Cuantificación del Factor de Necrosis Tumoral en Tejido Pulpar y Lesiones Periapicales

MATERIALES Y MÉTODOS

Se seleccionaron 10 pulpas de dientes permanentes y 10 pulpas de dientes temporales clínicamente sanos y cuyas pruebas de sensibilidad corroboraron que las pulpas estaban vitales; 14 pulpas con diagnóstico clínico de pulpitis irreversible, y 12 lesiones periapicales crónicas de origen endodóntico.

Para la recolección de las muestras del Primer y Segundo Grupo, se tuvo como parámetros de diagnóstico clínico, dientes que no tenían ningún proceso carioso y a los cuales se les realizó pruebas de sensibilidad eléctrica mediante un vitalómetro y la respuesta fue comparada con el diente contralateral. Una vez establecido el diagnóstico de pulpa clínicamente sana, se anestesió al paciente con Xilocaína al 2% con Epinefrina, posteriormente se realizó la apertura se realizó la apertura coronaria con fresa redonda No. 2 refrigerada y alta velocidad, una vez terminada la apertura se procedió a la extirpación del tejido pulpar mediante una sonda barbada; el tejido pulapr extirpado se colocó en un tubo de ensayo con 2mm de medio de cultivo (RPMI) y las muestras se congelaron a -70° C dentro de los 60 minutos siguientes; se esperó hasta recolectar todas las muestras para empezar su procesamiento.

Para el Tercer Grupo, se tomaron dientes cuyo diagnóstico clínico con base en los signos y síntomas fue de Pulpitis Irreversible Aguda. Se anestesió al paciente, se realizó la apertura coronaria, la extirpación de tejido pulpar y se colocó en el medio de cultivo de manera similar al Grupo No. 1.

Para el Grupo No. 4, se tomaron lesiones periapicales de origen endodóntico (Se excluyeron los compromisos de origen periodontal) de dientes que tenían indicado tratamiento quirúrgico periapical. Se tomó radiografía periapical del diente afectado, posteriormente bajo anestesia local se diseñó un procedimiento quirúrgico de acceso y visibilidad al área apical, con una mínima manipulación de esta zona. Seguidamente con una cureta de lucas la lesión apical fue removida e introducida en un frasco estéril con 2ml de PBS y antes de una hora fueron congelados a -70° C.

Una vez recolectadas todas las muestras se procesaron así: Se descongelaron los vials con las muestras, se sacaron los especímenes completos y/o fragmentados, se pesaron en una balanza de precisión, luego cada muestra se colocó en un eppendorff que contenía 1 ml de una solución de PBS con 2 ul (microlitros) de azida de Na al 0.02%. Se esperó una hora y luego se llevó al homogenizador mecánico de émbolo donde se homogenizó hasta solubilizar el tejido en la solución. Se pasó a un eppendorff y se centrifugó a 50.000 RPM en la microcentrífuga por dos minutos; se almacenaron todas las muestras a 4° C hasta el día siguiente, en el que se inició el procedimiento para realizar la técnica de ELISA.

Relación entre concentración de TNF y la Absorción
(Controles Positivos):

CANTIDAD TNF (X)ABSORBANCIA (Y)
20 ng
10 ng
7 ng
5 ng
1 ng
0.069
0.037
0.028
0.018
0.009

DETECCIÓN Y CUANTIFICACION DEL TNF MEDIANTE LA TÉCNICA DE ELISA (ENSAYO INMUNO ENZIMATICO EN FASE SOLIDA PARA ANTIGENOS SOLUBLES)

1. Se montaron 96 pozos de ELISA en un marco de portapozos en cada una de las pruebas.
2. Se colocaron 100 microlitros por pozo, de soluciones de antígeno, de TNF puro por duplicado en las columnas No. 1 y No. 2 a diferentes concentraciones: 1.000, 500, 250, 100, 50, y 25 nanogramos.
3. Se colocaron 100 microlitros en las columnas restantes, del sobrenadante de cada una de las muestras por duplicado y a tres diferentes diluciones en PBS puro: 1:1 y 1:10.
4. Se colocaron 100 microlitros en tres pozos del sobrenadante de una solución preparada macerando una hoja en pBS, como control negativo.
5. En los pozos sobrantes se colocaron 100 microlitros de PBS como blancos y a continuación se cubrieron para evitar la evaporación (controles sin antígeno).
6. Se incubó a 37° C por una hora, se dejó toda la noche a 4° C y luego una hora a 37° C.
7. Se removió al antígeno no unido, volteando de un solo movimiento el marco con los pozos y se lavó tres veces con 100 microlitros de PBS-Tween, dejando 1 minuto entre cada lavado.
8. Se colocaron 100 microlitros de una solución de suero de conejo No. 2 con PBS, en dilución de 1:500, en todos los pozos (antisuero).
9. Se incubó a 37° C por una hora y media.
10. Se removió y se lavó con PBS Tween, por tres veces como el número 7.
11. Se colocaron 100 microlitros de una solución fresca de Proteína A con Fosfatasa Alkalina en PBS (1 ul por 1 ml respectivamente), en todos los pozos.
12. Se incubó a 37° C por 40 minutos.
13. Se removió y se lavó por tres veces con pBS-Tween.
14. Se colocaron 100 microlitros de la solución reveladora recién preparada en cada uno de los pozos.
15. Se dejó temperatura ambiente hasta que se desarrolló el color, usualmente una hora y media.
16. Se añadieron 50 microlitros de solución frenadora.
17. Se leyó en el lector de ELISA a 405 manómetros.

RESULTADOS

Cuando se realizaron todos los ELISA y se realizó la lectura de la absorbancia en todos los pozos, los resultados fueron consignados en un formato diseñado previamente los cuales se detallan en la Tabla No. 1 donde observamos la absorbancia dada por las diferentes concentraciones de TNF usadas como controles positivos y en las tablas No. 1-2-3-4 donde se describen laos datos de: Diagnóstico, No de la muestra, peso, absorbancia y concentración de TNF.

Tabla No. 1.
ANALISIS ESTADISTICO

DxNo. MuestraPeso TotalAbsorbancia TotalAbsorbancia 1 mgr( ) de TNFX
PERMANENTES
SANAS
12
16
17
18
20
21
22
24
27
7.44
50.64
33.00
39.49
1.23
32.2
8.10
7.0
38.19
0.022
0.108
0.039
0.015
0.092
0.108
0.104
0.008
0.004
0.000
0.0021
0.0011
0.000
0.000
0.0032
0.0128
0.0011
0.0001
0
0
0
0
0
0
2.57
0
0
0.285

Tabla No. 2.

DxNo. MuestraPeso TotalAbsorbancia TotalAbsorbancia 1 mgr( ) de TNFX
TEMPORALES13
14
15
19
23
25
26
-2.05
4.60
51.01
4.11
21.68
17.49
12.0
-0.063
-0.006
0.026
0.009
0.196
0.027
-0.009
0.0
0.00
0.0005
0.0021
0.0090
0.0015
0.000
0
0
0
0
1.39
0
0
0.198

Tabla No. 3.

DxNo.
Muestra
Peso TotalAbsorbancia TotalAbsorbancia 1 mgr( ) de TNFX
P
U
L
P
I
T
I
S
I
R
R
E
V
E
R
S
I
B
L
E
A
G
U
D
A
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
7.28
15.50
1.45
6.58
5.90
6.32
18.6
10.03
16.7
6.78
5.0
1.32
0.224
0.140
0.078
0.199
0.094
0.211
0.184
0.241
0.120
0.054
0.087
0.061
0.0307
0.0965
0.0537
0.0302
0.0259
0.0333
0.0098
0.0240
0.00071
0.00174
0.00174
0.0462
8.136
28.57
15.27
7.98
3.24
8.94
1.645
6.05
0.8
4.006
4.006
12.95
8.49

Tabla No. 4.

DxNo. MuestraPeso TotalAbsorbancia TotalAbsorbancia 1 mgr( ) de TNFX
LESIÓN
APICAL
CRÓNICA
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
11.24
12.85
25.52
8.03
44.37
18.06
22.44
7.54
9.47
15.66
20.02
0.258
0.224
0.315
0.175
0.012
0.192
0.228
0.202
0.074
0.103
0.180
0.0229
0.0174
0.0123
0.0217
0.0002
0.0106
0.0101
0.267
0.0078
0.0065
0.0089
5.71
4.006
4.42
5.34
0
1.89
1.73
6.89
1.02
0.62
1.36
2.81

Como teníamos valores conocidos de absorbancia de diferentes concentraciones de TNF decidimos utilizar el análisis de regresión y así poder estimar la concentración de TNF en las diferentes muestras teniendo como variable dependiente la absorbancia. Como se tenían diferentes absorbancias para una misma muestra, se escogió el valor máximo de ésta en cada muestra para elaborar un gráfico de dispersión (gráfico A).

Gráfico A.
Relación entre la concentración de TNF y la Absorbancia
(Controles Positivos)

Relación entre la concentración de TNF y la Absorbancia
De acuerdo a este gráfico se obtuvo un modelo general que se expresa así:

y = M X +b

y= 0.00452 + 0.00322 X

Donde y = Absorbancia de las muestras y la concentración de TNF va a estar dada por X, es decir

………….y – 0.00452
X = ______________
……………0.00322

Por medio de este modelo podemos estimar la concentración de TNF de cada una de las muestras y así podemos realizar comparaciones de los valores estimados de TNF entre los grupos experimentales.

Se estimó en 0.285 ngr el promedio de concentración de TNF para pulpas permanentes sanas, de 0.198 ngr para pulpas temporales sanas, para las lesiones apicales de 2.81 ngr y para las pulpas con diagnósticos de pulpitis irreversible aguda de 8.49 ngr de promedio de TNF.

Estos promedios fueron comparados entre sí como se observa en las tablas No. 5 y 6 y en el gráfico No. 1.

Tabla No. 5.
Resultados.
PROPORCIÓN DE CANTIDAD DE TNF EN PULPITIS
IRREVERSIBLE AGUDA Y LESIONES APICALES.

_
X TNF P.I.A……………………………………….8.49ng
=======================================….= 3.021
_
X TNF LESION APICAL…………………….2.81ng

Tabla No. 6.
Resultados.
PROPORCIÓN DE CANTIDAD DE TNF EN P.I.A.
y PULPAS PERMANENTES SANAS.

_
X TNF P.I.A……………………………………….8.49ng
=======================================….= 29.78
_
X TNF PULPAS SANAS……………………0.285ng

Gráfica No. 1.
PROMEDIO CONCENTRACIÓN DE TNF.

Promedio Concentración de Tnf
También se realizó otro análisis de los resultados basados en la relación entre el peso de la muestra y la concentración de TNF de los diferentes grupos experimentales y estos resultados se detallan en los gráficos No. 2-3-4 y 5. De acuerdo a esto no se encuentra una relación entre la concentración de TNF y el peso de las muestras.

Gráfica No. 2.
Permanentes sanas
Proporción peso/Concentración TNF

Peso( ) TNF
1.23
7.0
7.44
8.10
32.2
33.0
38.19
39.49
5.64
0
0
0
2.57
0
0
0
0
0

Gráfica No. 2.
Permanentes sanas.

Permanentes sanas

Gráfica No. 3.
Temporales sanas
Proporción peso/Concentración TNF

Peso( ) TNF
-2.05
4.11
4.60
12.0
17.49
21.68
51.01
0
0
0
0
0
1.39
0

Gráfica No. 3.
Temporales sanas.

Temporales sanas

Gráfica No. 4.
Lesión Apical
Proporción peso/Concentración TNF

Peso (X)( ) TNF (Y)
7.54
8.03
9.47
11.24
12.85
15.66
18.06
20.02
22.44
25.52
44.37
6.89
5.34
1.02
5.71
4.006
0.62
1.89
1.36
1.73
2.42
0

Gráfica No. 4.
Lesión Apical

Lesión Apical

Gráfica No. 5.
Pulpitis Irreversible Aguda
Proporción peso/Concentración TNF

Peso (X)(Y)( ) TNF
1.32
1.45
5.0
5.9
6.32
6.58
6.78
7.28
10.03
15.50
16.70
18.6
12.95
15.27
4.006
3.54
8.94
7.98
4.006
8.136
6.05
28.57
0.80
1.645

Gráfica No. 5.
Pulpitis Irreversible Aguda

Pulpitis Irreversible Aguda

ANALISIS DE LOS RESULTADOS

Pulpas Temporales y permanentes Sanas:

La cuantificación de TNF en pulpas de dientes temporales y permanentes sanos fue cero con excepción de dos muestras en las cuales la concentración de TNF está en bajas cantidades (2.57 y 1.39 ngr).

Pulpas Permanentes con diagnóstico clínico de Pulpitis Irreversible Aguda:

No hay ninguna relación entre peso y cantidad de TNF; en su lugar existe una diversidad en la respuesta de las muestras con respecto a la producción de TNF. En este grupo se encontró la concentración más alta de TNF con respecto a los otros grupos experimentales.

Lesiones Apicales Crónicas:

Como ocurrió con la pulpitis irreversible aguda, no hay relación entre peso y cantidad de TNF, medido por la técnica de ELISA; sin embrago, contrasta con ésta en que los valores de TNF hallados son menores y las diferencias entre dichos valores no son tan amplias como las pulpitis irreversibles agudas.

Los valores encontrados de TNF son menores que los de pulpitis irreversible aguda pero significativamente mayores que los de las pulpas temporales y permanentes sanas; esto se observa por la comparación proporcional de las concentraciones estimadas de acuerdo a las tablas No. 5 y 6.

Anterior Siguiente

DÉJANOS TU COMENTARIO

DÉJANOS TU COMENTARIO

Please enter your comment!