PACIENTES Y MÉTODOS
Pacientes. Durante este estudio se evaluaron 8 familias con evidencia clínica de RTH, de las cuales, dos (familia RTH 2 y familia RTH 8) son de interés para el estudio, dado que presentan mutaciones en el gen TRβ que pueden ser las responsables del RTH.
El estudio fue aprobado por el comité de éticade la Universidad de Los Andes y todos los sujetos firmaron el consentimiento informado. En el caso de los individuos menores de edad, sus padres lo firmaron.
La familia 2 es de la ciudad de Bogotá, cuyo propósito es un paciente masculino que tenía 8meses de edad en el momento de la primera evaluación clínica y primera sospecha de RTH. Existe evidencia previa de hipotiroidismo en la madre y varios familiares, por lo que se evaluaron los miembros de la familia que estaban interesados en participar en el estudio.
La familia 8 es de la ciudad de Cali, cuyo propósito es un niño de 3 años de edad, quien presentó evidencia clínica de RTH a los 15 meses de edad. El niño presenta craneosinostosis a los 9 meses de edad, retraso del desarrollo psicomotriz, hipoacusia, disminución de la agudeza visual, sudoroso y sin taquicardia. Empezó a gatear a los 15 meses y a caminar a los 22 meses de nacido. Adicionalmente, presentó crisis convulsivas en 3 ocasiones. Su madre de 35 años presenta alteraciones visuales, mientras que su padre de 44 años y sus hermanas de 17 y 7 años no presentan ningún síntoma de RTH.
Se llevaron a cabo las correspondientes pruebas hormonales para evaluar las concentraciones de T3 total, T4 total, T4 libre y TSH. Adicionalmente se realizó una gammagrafía con el fin de evaluar la glándula tiroidea en el propósito de la familia 8.
Aislamiento de ADN. El ADN genómico fue aislado de glóbulos blancos de sangre periférica, utilizando el kit para aislamiento de ADN humano de Corpogen DNA 2000.
Amplificación del gen TRβ. Por un lado, para la familia 2, se llevó a cabo la amplificación por PCR de los exones 7-10 del gen TRβ del propósito, en el cual se identificó una mutación no sinónima en el exón 8. Con el fin de identificar, posteriormente, la mutación en los demás miembros de la familia se realizó amplificación por PCR seguida de una digestión con la enzima de restricción HindIII. Así mismo, se llevó a cabo la misma digestión en 100 cromosomas de la población control para confirmar que la mutación estuviera presente únicamente en la familia y no fuera un polimorfismo presente en la población.
Por otro lado, para la familia 8, se amplificaron por PCR los exones 7-10 del gen TRβ del propósito. Una vez se encontró la mutación en el exón 10 del gen TRβ en el propósito, se realizó a continuación la amplificación de dicho exón de sus padres y de sus dos hermanas.
Las reacciones de PCR fueron amplificadas en un volumen final de 25μl que contenía: 21 μl de 2X PCR Green Master Mix (Promega), 1 μl de cada primer y 2 μl de DNA templado. Se utilizaron primers reportados previamente en la literatura que se muestran en la tabla 1.
Secuenciación de ADN. Los productos de PCR fueron purificados con el kit ExoSap (Fermentas) y posteriormente fueron secuenciados por el método de Sanger. La secuenciación se realizó en sentido forward y reverse empleándolos mismos primers utilizados en la amplificación.
