Artículo de Investigación: Pacientes con Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica en Bogotá, Colombia

Frecuencia de la Colonización por Pneumocystis Jirovecii en Pacientes con Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica en Bogotá, Colombia

Juan Felipe Burbano-Gutiérrez1, José Enrique Cita-Pardo1, Catalina Hernández-Flórez2, Claudia M. Parra-Giraldo3, Javier Ricardo Garzón-Herazo4, Melva Y. Linares-Linare5 y Alejandra Cañas-Arboleda6

Resumen

Antecedentes: la colonización por Pneumocystis jirovecci (P. jirovecii) se ha postulado como causa de deterioro de la función pulmonar en pacientes con Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica (EPOC). Se desconocía la frecuencia de aparición de la colonización por P. jirovencii en esa población en Colombia. Objetivo: documentar la frecuencia de colonización por P. jirovecii en mayores de 40 años con EPOC excluyendo a los pacientes que requirieran manejo inmunosupresor y a las personas infectadas por el Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH). Materiales y métodos: se trató de un estudio de corte transversal, que contó con muestreo no probabilístico por conveniencia y selección continua de pacientes. Se realizó PCR (reacción en cadena de polimerasa) en tiempo real (rt-PCR) del esputo inducido con el Kit LighMix de P. jirovecii (Roche®-Suiza) amplificándose un fragmento de 244 pares de bases a partir del gen de la glicoproteína de superfi cie del hongo. Resultados: para una muestra de 52 pacientes en total, se documentó una frecuencia de colonización del 15,4% en todos los participantes mayores de 65 años, quienes además presentaron altos índices de sintomatología según la escala modificada Medical Research Council (MR Cm) y el cuestionario de evaluación de la EPOC (CAT). La mayoría de pacientes analizados se clasificó como GOLD D (63%) en la clasificación por la Iniciativa Global para la EPOC. Conclusiones: la frecuencia de colonización por P. jirovecii en pacientes con EPOC detectada por rt-PCR en el esputo inducido fue del 15,4%. Este constituye el primer estudio colombiano que evalúa la frecuencia de colonización del hongo.
Palabras claves: Pneumocystis jirovecii; Pneumocystis carinii; Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica; EPOC. (DeCS)

Pneumocystis Jirovecii Colonization Frequency in Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) Patients in Bogota, Colombia

Abstract

Background: Pneumocystis jirovecii colonization has been proposed as the explanation for lung function decline in patients with Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD). The colonization frequency due to Pneumocystis jirovecii in this group of patients was yet unknown in Colombia. Objective: To document the frequency of colonization in patients over 40 years old with COPD diagnosis. The study excludes patients who require immunosuppressive treatment and who are infected with Human Immunodeficiency Virus (HIV). Materials and methods: A cross-sectional study was held, using non-probabilistic convenience sampling with continuous patient selection. Real time PCR (rt-PCR) of P. jirovecii was performed in an induced sputum sample, the fragment of 244 base pairs from the major surface glycoprotein gene of the fungus was amplified using the LighMix Kit (Roche®-Switzerland). Results: From the sample of 52 patients, we found a frequency of colonization of 15.4%. All colonized patients were over 65 years old with high symptomatology levels according to the modified Medical Research Council scale (MRCm), and the COPD Evaluation Test (CAT). Most of the colonized patients were classified as GOLD D (63%), as rated by the Global Initiative for COPD. Conclusions: The colonization frequency due to P. jirovecii in COPD patients detected by rt-PCR in induced sputum was 15.4%. This is the fi rst study to assess the frequency of P. jirovecii colonization in Colombia.

Key words: Pneumocystis jirovecii; Pneumocystis carinii; Chronic Obstructive Pulmonary Disease; COPD. (DeCS)

Introducción

En la actualidad, se reconoce el papel etiológico del Pneumocystis jirovecii (P. jirovecii) como microorganismo oportunista en pacientes inmunosuprimidos y, especialmente, en los infectados por el Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) o en personas recibieron esteroides, terapias anti FNT-α (factor de necrosis tumoral alfa) y trasplantes. En Colombia, el estudio de Acevedo et al. reportó un valor del 11,9% de incidencia de la neumonía por P. jirovencii en pacientes con VIH y esta se consideró una de las principales infecciones oportunistas presentes en esta población (1).

Otro escenario menos estudiado es la colonización del tracto respiratorio, definido como como la detección del hongo en pacientes sin síntomas ni signos sugestivos de neumonía (2). Los métodos tradicionales de visualización directa del microorganismo solo detectan altas cargas microbiológicas. Diferentes estudios han encontrado que la carga fúngica asociada con la colonización es mucho menor que la descrita en pacientes con infección, por esta razón, la mejor forma de documentar el estado de la colonización involucra la aplicación de métodos moleculares (3, 4). Los estudios realizados en animales y humanos han documentado un papel importante de la colonización por P. jirovecii en la respuesta inflamatoria local y sistémica acompañada de cambios estructurales y deterioro de la función pulmonar, reacción muy similar a la de los pacientes con Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica (EPOC) (5, 6, 7, 8). En la República de China, se evaluó prevalencia de colonización por P. jirovecii en pacientes con enfermedades pulmonares crónicas mediante el método de LAMP detectando el microorganismo en 62 de 98 muestras de esputo (63,3%) (9).

En ese contexto, el objetivo del presente estudio consiste en determinar la frecuencia de la colonización por este hongo en un grupo de pacientes con EPOC. Este representa el primer estudio que aborda esta problemática en esa población, en Colombia. Así pues, los resultados permitirán establecer la importancia de implementar una estrategia de búsqueda y la realización de estudios futuros, que podrían impactar en la reducción del número de exacerbaciones y el costo del tratamiento teniendo en cuenta el porcentaje de la prevalencia del 8,9% de la EPOC en nuestro país (10).

Materiales y Métodos

Se realizó un estudio de corte transversal y un muestreo consecutivo por conveniencia, desde mayo del 2015 a mayo de 2016, contando con el consentimiento informado de un grupo de pacientes mayores de 40 años con diagnóstico de EPOC, provenientes de la consulta externa de neumología de dos instituciones de nivel II y IV. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética e Investigaciones de las instituciones. Para el diagnóstico de la enfermedad pulmonar, se utilizó la definición de la Iniciativa Global para la EPOC (GOLD) 2014 (11): presencia de disnea, tos crónica o producción de esputo, con historia de exposición a factores de riesgo para la enfermedad y la relación de volumen espiratorio forzado en un segundo sobre la capacidad vital forzada posbroncodilatadora (VEF1/CVF post) <0,7.

Fueron excluidos del estudio los pacientes positivos para VIH; aquellos que hubieran recibido trasplantes de órgano sólido o médula ósea; quienes presentaran enfermedades autoinmunes, neoplasia de órgano sólido o linfoproliferativa que hubieran sido tratados mediante quimioterapia. Así mismo, fueron descartados aquellos pacientes que manifestaran la presencia de cualquier enfermedad o condición que requiriera tratamiento inmunosupresor con metotrexate, ciclosporina, azatioprina, terapia biológica o el consumo de 15 mg o más de prednisolona al día o su equivalente durante el mes anterior.

Se tuvieron en cuenta las siguientes variables: género, edad, tabaquismo, exposición a humo de leña, comorbilidades, exacerbaciones en el último año, severidad y clasificación de la EPOC; el Índice de Masa Corporal (IMC), la clasificación de la disnea por medio de la escala modificada del Medical Research Council (MRCm), el cuestionario de evaluación de la EPOC (CAT), la curva de flujo de volumen pre y posbroncodilatador, el tratamiento y el examen físico.

A todos los pacientes, se les realizó la detección cualitativa de los anticuerpos tipos 1 y 2 frente al VIH con inmunoanálisis quimioluminiscente de micropartículas, curva de flujo de volumen pre y posbroncodilatador en el pletismógrafo MasterScreen Body (Jaeger), según los estándares exigidos por la Sociedad Americana de Tórax, en relación con las características de validación y control de calidad. Se calculó el GOLD 2014 (9) y el índice BODEx (12) el cual combina cuatro variables: IMC, obstrucción al flujo aéreo medido de acuerdo con el porcentaje del predicho por el FEV1 post., la disnea determinada mediante la escala MRCm y las exacerbaciones graves reportadas durante el último año.

A todos los pacientes se les realizó una micronebulización con solución salina hipertónica para obtener una muestra inducida de esputo, según los parámetros establecidos por la Sociedad Europea de Neumología (13, 14). En caso de que la muestra no fuera representativa, se repetía la prueba después de 48 horas, en concordancia con los estándares referidos. Las muestras de esputo inducido se trataron con solución mucolítica compuesta por hidróxido de sodio al 4%, citrato trisódico al 3% y N-acetil-L-cisteína en polvo mediante centrifugación a 3000 rpm. Posteriormente, se adicionó una solución buffer fosfato preparada con fosfato disódico y fosfato monopotásico para evitar los cambios de pH y para, simultáneamente, diluir y neutralizar las sustancias tóxicas.

La extracción de ADN se realizó con el estuche comercial High Pure PCR Template Preparation (Roche®-Suiza) de acuerdo con las recomendaciones sugeridas por la casa comercial. El producto eluído fue cuantificado con el espectrofotómetro Biospectrometer (eppendorf). La PCR en tiempo real (rt-PCR) se realizó con el estuche LighMix Kit P. jirovecii (Roche). Mediante la rt-PCR, se amplificó un fragmento de 244 pares de bases (pb) a partir del gen de la glicoproteína de superficie del P. jirovecii, que fue amplificado con un par de iniciadores marcados con la sonda Red 640 que se detecta en el canal 640λ. La reacción de rt-PCR tuvo un control interno de un fragmento de 278 pb, el cual es una sonda de hibridación marcada con la sonda Red 690 que es detectada en el canal 705λ. La amplificación se realizó en el equipo LightCycler® 2,0 (Roche) bajo las siguientes condiciones: denaturación a 95°C por 10 minutos, amplificación mediante 50 ciclos (95°C por 5s, 62°C por 5s y 72°C por 15s) y un paso de enfriamiento a 40°C por 30s.

Análisis Estadístico

En las variables cualitativas, se utilizaron distribuciones de frecuencias absolutas y porcentajes; en las cuantitativas, medidas de tendencia central, promedio y mediana; y en las de dispersión, el rango y desviación estándar.

Consideraciones Éticas

El protocolo fue aceptado por el Comité de Ética de las instituciones. Se obtuvo consentimiento informado de todos los pacientes.

De acuerdo con la resolución 8430 de 1993 este estudio se clasifica como investigación con riesgo mínimo dado que se expuso a los pacientes a esputo inducido con solución salina al 3%, espirometría pre y posbroncodilatador.


1 MD, Esp. Hospital Universitario San Ignacio, Departamento de Medicina Interna, Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, Colombia.
2 MD, MSc. Hospital Universitario San Ignacio, Deprtamento de Medicina Interna, Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, Colombia.
3 MD, MSc, PhD. Hospital Universitario San Ignacio, Grupo de Enfermedades Infecciosas, Unidad de Infectología, Departamento de Medicina Interna y Grupo de Enfermedades Infecciosas, Departamento de Microbiología, Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, Colombia.
4 MD, Esp. Hospital Universitario San Ignacio, Grupo de Enfermedades Infecciosas, Unidad de Infectología, Departamento de Medicina Interna, Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, Colombia.
5 MD, MSc. Grupo de Enfermedades Infecciosas, Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias, Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, Colombia.
6 MD, Esp. Hospital Universitario San Ignacio, Grupo de Enfermedades Infecciosas, Unidad de Infectología, Departamento de Medicina Interna y Unidad de Neumología, Departamento de Medicina Interna, Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, Colombia.

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