Cuantificación del Factor de Necrosis Tumoral en Tejido Pulpar y Lesiones Periapicales

INTERLEUKINAS EN INFLAMACIÓN

Las monoquinas tales como la Interleuquina 1 y el factor de necrosis tumoral, median un amplio espectro de efectos biológicos. Algunas de estas son producidas por macrófagos; y se ha demostrado que inducen reabsorción ósea osteoclástica.

Su producción es estimulada por factores exógenos y endógenos producidos por bacterias, virus y tumores. Los lipopolisacáridos son un potente estímulo para la biosíntesis del TNF. En la circulación los lipopolisacáridos son un potente estímulo par la biosíntesis del TNF. En la circulación los lipopolisacáridos se unen a una proteína transportadora y este complejo interactúa con el CD14 (receptor de membrana) sobre la membrana de los macrófagos e inducen la síntesis del TNF. Después de la inducción se estimula la expresión del gen TNF y grandes cantidades de la proteína es liberada hacia la matriz extracelular.

El TNF inicialmente existe como una molécula de 26K asociada a la membrana celular. Este TNF es procesado por un clivaje proteolítico y da un péptido de 17 Kd; 3 moléculas de éstas se unen en forma de complejo homotrimétrico que es biológicamente activo.

El TNF tiene un comportamiento característico cuando es estimulada su producción en los tejidos, cuando se administran dosis intravenosas de endotoxinas, niveles altos del TNF son detectados a las 4-6 horas, pero su se administra en forma constante el lipopolisacárido (Ag) se observa una disminución en las concentraciones del TNF.

FUNCIONES DEL TNF

La acción biológica de esta glicoproteína depende de la concentración en que se encuentra. A bajas concentraciones tiene las siguientes funciones:

1. Facilitan la adhesión de los neutrófilos a las células endoteliales. Esta acción contribuye a la acumulación de leucocitos en la inflamación.
2. El TNF es un potente activador de los neutrófilos.
3. Estimula macrófagos y otras células a producir citokinas incluyendo IL-1, IL-6.
4. Puede funcionar como un coestimulador para activación de células T y B.
5. Ejerce un efecto protector contra virus similar al del interferon.
En concentraciones altas tiene otras funciones:
1. Pirógeno endógeno.
2. Estimula producción de proteínas de la fase aguda de la inflamación.
3. Puede activar el sistema de la coagulación, principalmente por alteración del balance de la actividad procoagulante y anticoagulante del endotelio vascular.

La otra función que tiene la molécula de TNF es la de producir activación del osteoclasto en los procesos de reabsorción ósea. El TNF induce la liberación de calcio del tejido óseo in vitro y puede jugar un papel importante en una variedad de enfermedades inflamatorias donde se involucra el proceso de reabsorción ósea.

Los lipopolisacáridos producidos por las bacterias están relacionados con la producción de periodontitis apical y con la reabsorción ósea.

El tejido inflamatorio presente en la periodontitis apical crónica es poblado predominantemente por macrófagos. Se debe esperar por lo tanto, que altos niveles de TNF pueden estar presentes en los tejidos periapicales de los dientes con patologías periapicales.

Se han realizado algunos estudios para cuantificar el TNF en tejido pulpar y lesiones apicales, uno de ellos es el de Kamran y colaboradores que estudiaron la presencia de factor de necrosis tumoral en exudado de lesiones periapicales de dientes que eran clínicamente asintomáticos, pero con necrosis pulpar. Al examen radiográfico se onbservaba imagen radiolDcida a nivel periapical. Las muestras se toman inmediatamente después de la apertura cameral. Como grupo control se utilizaron 5 dientes que no tenían evidencia de patología pulpar o periapical, pero que necesitaban tratamiento convencional de endondoncia. En este caso las muestras fueron tomadas de los fluidos tisulares dentro de los conductos radiculares después de la extirpación pulpar.

Los dientes utilizados en la muestra fueron aislados con tela de caucho y desinfectados con solución de Iodine al 5%, se realizaron las aperturas con fresa redonda No. 2 y se obtuvo la longitud de trabajo (conductometría) mediante radiografía periapical, seguidamente fue introducida una punta de papel dentro del conducto radicular y cada una de ellas una vez retirada fue colocada en un tubo estéril; posteriormente las muestras fueron llevadas al laboratorio y mantenidas a 4° C hasta ser analizadas para la presencia de TNF. Para ésta cuantificación se utilizó un ensayo inmunoabsorbente utilizando anticuerpo monoclonal anti-TNF de la siguiente manera: Cada cono de papel fue colocado en tubos separados a los cuales se les adicionó medio de cultivo (PBS) mas suero fetal bovino al 2%; las muestras se incubaron a 37° C por una hora; las puntas de papel fueron removidas y al medio se le adicionó en Anticuerpo Monoclonal TNF en una solución de 0.1 molar; se incubó nuevamente la muestra a temperatura ambiente durante 4 horas, se realizaron 4 lavados con medio de cultivo y posteriormente se le adicionó el Anti-TNF de conejo marcado con Peroxidasa y se cuantificó la reacción colorimétrica de cada una de las muestras mediante un colorímetro.

En los resultados se reporta la presencia de TNF en diferentes concentraciones, siendo más alta en procesos inflamatorios que en los grupos control. Recomiendan el estudio del TNF mediante al obtención de muestras en forma directa, es decir, corte de lesiones periapicales para poder cuantificar con mayor exactitud la presencia de TNF.

TECNICAS UTILIZADAS EN LA DETECCIÓN DE SUSTANCIAS

Como el objetivo de este estudio es el de detectar y cuantificar la cantidad de TNF en el tejido pulpar y periapical, se revisaron los conceptos fundamentales para la técnica de Ac monoclonales, como también la preparación de las muestras.

Casi siempre las técncias de análisis cualitativo o cunatitativo para la detección de sustancias, requieren que las moléculas a analizar estén en una solución acuosa o en un solvente sobre lípidos, si son de naturaleza lipídica. Cuando las sustancias a estudiar están en un medio biológico líquido, como por ejemplo en el plasma sanguíneo, el trabajo de la preparación está simplificado porque las moléculas ya están disueltas. Por el contrario, si las sustancias no están en solución, es indispensable extraerlas, es decir, someter el tejido macerado a la acción de una solución conveniente en la cual, al cabo de unas horas, al agitar la molécula a estudiar, estará solubilizada. Por ejemplo, se pueden extraer ciertas moléculas con una solución neutra de baja concentración (NaCl, 0.1 M/1to). La solución más elemental consiste en utilizar reactivos como la azida de sodio (NaN3) al 0.02% y condiciones físicas que no alteren la molécula buscada, operando el material como mínimo, en una cámara fría a 4° C, lo que impide la mayor parte de las proliferaciones bacterianas.

Si la molécula buscada está muy ligada a la estructura celular, es necesario separarla por medio de una solución detergente. Los detergentes son moléculas preparadas por síntesis orgánica que tienen propiedades anfipáticas. Es decir, sus moléculas se asocian a los lípidos por un extremo de la molécula y al agua por el otro extremo cargado eléctricamente. Esta sustancias son en consecuencia, capaces de unirse a las materias lipídicas y de llevarlas en solución acuosa. Algunos detergentes tienen una acción desnaturalizante que se debe tener en cuenta cuando se están aislando proteínas.

Los detergentes pueden ser iónicos (aniónicos) y no iónicos (no aniónicos). Los primeros suelen ser más activos y más efectivos en la solubilización de proteínas, produciendo un mayor grado de desnaturalización, según sea su concentración. Los más usados principalmente para procedimientos de electroforesis, son el Dodecil Sulfato Sódico (SDS) y el Deoxicolato de Sodio. Los “no iónicos” son comúnmente usados para solubilizar proteínas de membranas o para solubilizar proteínas de una forma tal que no afecte la “actividad biológica” de la proteína. El mas comúnmente usado es el Tritón X-100 utilizado para solubilizar tejidos, en los cuales se quiere detectar proteínas por métodos de inmunoensayo como el de ELISA.

La técnica utilizada en el presente estudio fue la de cuantificación de Acs policlonales mediante la técnica de Elisa.

Para entender los fundamentos de la metodología utilizada en la investigación, debemos revisar los conceptos básicos de las reacciones antígeno-anticuerpo.

ANTICUERPOS MONOCLONALES

Se parte de dos principios fundamentales:

1. Una célula (linfocito B) produce anticuerpos específicos para cada antígeno, de acuerdo con la teoría de la selección clonal de Burnet.
2. Se requiere la hibridización de células productoras de anticuerpos con células de mieloma para generar hidridomas en los cuales estén combinadas las virtudes de secreción de un anticuerpo, con el crecimiento continuo. Una posterior selección y clonaje de las células híbridas permite la derivación de anticuerpos monoclonales de una especificidad predefinida y con la actividad deseada.

La producción de Anticuerpos Policlonales es otra técnica usada para la cuantificación de sustancias, basada también en la combinación entre antígeno y anticuerpo.

Los anticuerpos policlonales son obtenidos de suero de animales previamente inmunizados con la sustancias (Antígeno) que se va a cuantificar.

La obtención de Anticuerpos se basa en el principio de que el sistema inmune de los mamíferos, cuando es estimulado por la presencia de un antígeno, sintetiza anticuerpos específicos contra éste, los cuales van a estar en latas concentraciones en el plasma.

Para que se produzca un anticuerpo específico por esta técnica, lo ideal es utilizar el antígeno “puro” para inmunizar el animal (conejo), con lo cual se logra una mayor especificidad, ya que, si bien los anticuerpos monoclonales son más específicos, existen circusntancias en las cuales ésta puede ser menos precisa que la esperada y donde la reactividad cruzada puede ser mayor de la que tiene el suero normal.

La técnica de Ac policlonales tiene la ventaja de ser mas sencilla, requiere un menor tiempo y es más económica que la técnica de anticuerpos monoclonales.

Además no es tan susceptible a ser afectada por las condiciones ambientales, tales como la temperatura y el pH, a diferencia de la técnica con Ac monoclonales, que es muy sensible.

Estos parámetros nos llevaron a escoger la técnica de Anticuerpos Policlonales para nuestro estudio.

Para la detección de anticuerpos policlonales, el método de ELISA (Enzime Linked Inmuno Absorbent Assay) o método Inmuno Enzimático en fase sólida, para Antígenos Solubles es le más utilizado, por su sensibilidad, sencillez y rapidez.

Esta prueba se basa en la capacidad que tiene la placa de microtitulación de adherir fuertemente las proteínas uniendo en cada pozo hasta nanogramos de proteína. Los anticuerpos (del suero en Ac policlonales) reaccionarán con el antígeno adherido a los pozos y esta unión se revelará con un segundo anticuerpo o la proteína A marcados con una enzima, las má usadas son: la fosfatasa alcalina y la peroxidasa.

El grado de unión del anticuerpo se evalúa midiendo el color desarrollado luego de la adición del sustrato y cromógeno (sc) correspondiente al sistema: el nivel del color presente es proporcional al nivel de enzima unido al anticuerpo.

Para la medición del color se utilizan detectores automáticos que permiten la lectura, registro y tabulación de los resultados de los pozos(24).

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