Cuantificación de Colagenasa en Pulpas de Dientes Temporales y Permanentes

* Dr. Jairo Sarmiento M.
Odontólogo U.N., Endodoncista U.J. Profesor U.N. y U.J.
** Dra. Elsa Clavijo L.
Odontóloga U.N. Estomatóloga Pediatra U.N., Profesor U.N.
** Dra. Layla Gonzálea B.
*** Dr. Carlos Guerrero F.
Médico Genetista U.N., Farmacólogo U.N., profesor U.N.
**** Dra. Clara Inés de Mayorga
Estadístico U.N., Profesor U.N.

RESUMEN

Con el fin de determinar y comparar la cantidad de colagenasa en pulpas de dientes temporales y permanentes, asociándola al proceso fisiológico de la reabsorción radicular en dientes temporales, se realizó este estudio en 25 pulpas sanas de 14 dientes permanentes y 11 temporales. SE cuantificó la cantidad de colagenasa empleando Anticuerpos Policlonales y detectándola por medio de la técnica de ELISA.

Se estimó un promedio de colagenasa para las pulpas de dientes temporales de 49.02 ng y para las pulpas de dientes permanentes de 35.72 ng. Estos hallazgos permiten evidenciar una diferencia significativa entre los dos tipos de pulpas, sin embargo es probable que el mecanismo de regulación enzimática no esté relacionado únicamente con la cantidad de la enzima, sino con su “actividad o inactividad” y por tanto la función de la colagenasa en la pulpa no sea igual en ambos tipos de dentición.

INTRODUCCIÓN

En los seres humanos existen dos tipos de dentición, la temporal que sufre un proceso de reabsorción fisiológica y la permanente, que no lo presenta.

No se ha dilucidado la causa del proceso fisiológico de reabsorción radicular en los dientes temporales, por el contrario se han postulado varias teorías que podrían explicarlo, como son: la actividad de osteoclastos y cementoclastos que aparecen con el aumento de la presión sanguínea en los tejidos que rodean la raíz dental (1)(2)(3)(4)(13)(15), la presión que ejerce el diente permanente en vía de erupción (1)(5)(6)(7)(14), factores genéticos predeterminantes y la actividad de ciertas enzimas que degradan el tejido dentario radicular. (8)(9)(10)(11)(12)(16)(17).

El tejido pulpar cumple funciones biológicas importantes y uno de sus principales elementos constitutivos es el colágeno(22)(23)(24). Si se parte de un dogma biológico fundamental: que toda proteína como sustrato que es, debe ser degradada por una enzima, en este caso, la enzima degradadora del colágeno sería la colagenasa(18)(19)(12)(20)(21). Resultados obtenidos en estudios anteriores(22)(25)(26) muestran que no existen diferencias histológicas en los tejidos pulpares de los dientes temporales y permanentes, pero sí existe una diferencia desde el punto de vista fisiológico, como es la reabsorción de los dientes temporales; por ésto, se cree que los mecanismos que producen estos fenómenos no se encuentran en los constituyentes histológicos del diente, sino a nivel enzimático.

Resulta pues conveniente y necesario, comparar la cantidad de la colagenasa en pulpas de dientes temporales y permanentes, con el fin de iniciar un proceso que permita establecer la razón por la cual ocurre la reabsorción en dientes temporales, planteándose la hipótesis de que debe existir una mayor cantidad de colagenasa en las pulpas de los dientes temporales que la que se encuentra en las pulpas de dientes permanentes.

Por esta razón, el propósito de este estudio fue cuantificar y comparar la cantidad de colagenasa en los tejidos pulpares de los dos tipos de dentición.

MATERIALES Y MÉTODOS

A. Recolección y preparación de las Muestras

Se tomaron 25 pulpas dentales sanas de niños o jóvenes de ambos sexos, sistemáticamente sanos entre 1 y 18 años, 11 de dientes temporales y 14 de permanentes, cuyos dientes requerían de exodoncia o endodoncia por indicación ortodóntica o procedimientos restauradores.

Las pulpas se obtuvieron en medio aséptico, por medio de sondas barbadas. Cada una se colocó en 1 ml de solución de RPMI y se congeló a -20° C. Una vez recolectadas todas las muestras se descongelaron, pesaron y homogenizaron cada una en 1 ml de una solución de PBS con 1 microlitro de tritón al 0.01% y 2 microlitros de azida de sodio al 0.02%, se centrifugaron y el sobrenadante fue el utilizado para su cuantificación, mediante la técnica de ELISA (Ensayo Inmuno Enzimático en Fase Sólida para Antígenos Solubles).

B. Obtención del Anticuerpo Policlonal contra la colagenasa (Antisuero):

El anticuerpo policlonal, se obtuvo a partir del suero de un conejo hembra previamente inmunizado con colagenasa pura. Se determinó mediante pruebas de “Inmunodott”, basadas en la reacción Antígeno-Anticuerpo, la presencia del anticuerpo contra la colagenasa y se encontró que la dilución óptima del suero era de 1:50.

C. Detección y cuantificación de la colagenasa mediante la técnica de ELISA:

Esta técnica fue escogida por su sensibilidad, confiabilidad, rapidez y costo accesible.

Se montaron 96 pozos de ELISA, colocándose en las dos primeras columnas 100 microlitros por pozo de diluciones seriadas de colagenasa pura a diferentes concentraciones: 1000, 500, 250, 100, 50 y 25 nanogramos.

Como controles negativos se colocaron en algunos pozos, 100 microlitros de una solución preparada macerando la hoja de una planta en PBS. Como blancos /controles sin antígeno) se pusieron 100 microlitros de PBS en otros pozos.

En los pozos restantes se colocaron 100 microlitros del sobrenadante de cada una de las muestras a diferentes diluciones en PBS: Puro, 1:1 y 1:10 (Figura 1).

Velocidad de conducción en hombres con dientes vitalesFigura No. 1.
Diagrama del Montaje en la Prueba de Elisa.

Se colocó luego la solución de suero de conejo de 1:500 que contenía el anticuerpo, para producir la reacción antígeno Anticuerpo, que luego se reveló mediante la colocación de Proteína A marcada con Fosfatasa Alkalina, la cual desarrolló un color al adicionarle Paranitrofenil fosfato como sustrato cromógeno, según el método descrito en el Manual de laboratorio, Instituto Nacional de Cancerología.

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