Cuantificación de Colagenasa en Pulpas de Dientes Temporales y Permanentes

Colagenasa en Pulpas de Dientes

* Dr. Jairo Sarmiento M.
Odontólogo U.N., Endodoncista U.J. Profesor U.N. y U.J.
** Dra. Elsa Clavijo L.
Odontóloga U.N. Estomatóloga Pediatra U.N., Profesor U.N.
** Dra. Layla Gonzálea B.
*** Dr. Carlos Guerrero F.
Médico Genetista U.N., Farmacólogo U.N., profesor U.N.
**** Dra. Clara Inés de Mayorga
Estadístico U.N., Profesor U.N.

RESUMEN

Con el fin de determinar y comparar la cantidad de colagenasa en pulpas de dientes temporales y permanentes, asociándola al proceso fisiológico de la reabsorción radicular en dientes temporales, se realizó este estudio en 25 pulpas sanas de 14 dientes permanentes y 11 temporales. SE cuantificó la cantidad de colagenasa empleando Anticuerpos Policlonales y detectándola por medio de la técnica de ELISA.

Se estimó un promedio de colagenasa para las pulpas de dientes temporales de 49.02 ng y para las pulpas de dientes permanentes de 35.72 ng. Estos hallazgos permiten evidenciar una diferencia significativa entre los dos tipos de pulpas, sin embargo es probable que el mecanismo de regulación enzimática no esté relacionado únicamente con la cantidad de la enzima, sino con su “actividad o inactividad” y por tanto la función de la colagenasa en la pulpa no sea igual en ambos tipos de dentición.

INTRODUCCIÓN

En los seres humanos existen dos tipos de dentición, la temporal que sufre un proceso de reabsorción fisiológica y la permanente, que no lo presenta.

No se ha dilucidado la causa del proceso fisiológico de reabsorción radicular en los dientes temporales, por el contrario se han postulado varias teorías que podrían explicarlo, como son: la actividad de osteoclastos y cementoclastos que aparecen con el aumento de la presión sanguínea en los tejidos que rodean la raíz dental (1)(2)(3)(4)(13)(15), la presión que ejerce el diente permanente en vía de erupción (1)(5)(6)(7)(14), factores genéticos predeterminantes y la actividad de ciertas enzimas que degradan el tejido dentario radicular. (8)(9)(10)(11)(12)(16)(17).

El tejido pulpar cumple funciones biológicas importantes y uno de sus principales elementos constitutivos es el colágeno(22)(23)(24). Si se parte de un dogma biológico fundamental: que toda proteína como sustrato que es, debe ser degradada por una enzima, en este caso, la enzima degradadora del colágeno sería la colagenasa(18)(19)(12)(20)(21).

Resultados obtenidos en estudios anteriores(22)(25)(26) muestran que no existen diferencias histológicas en los tejidos pulpares de los dientes temporales y permanentes, pero sí existe una diferencia desde el punto de vista fisiológico, como es la reabsorción de los dientes temporales; por ésto, se cree que los mecanismos que producen estos fenómenos no se encuentran en los constituyentes histológicos del diente, sino a nivel enzimático.

Resulta pues conveniente y necesario, comparar la cantidad de la colagenasa en pulpas de dientes temporales y permanentes, con el fin de iniciar un proceso que permita establecer la razón por la cual ocurre la reabsorción en dientes temporales, planteándose la hipótesis de que debe existir una mayor cantidad de colagenasa en las pulpas de los dientes temporales que la que se encuentra en las pulpas de dientes permanentes.

Por esta razón, el propósito de este estudio fue cuantificar y comparar la cantidad de colagenasa en los tejidos pulpares de los dos tipos de dentición.

MATERIALES Y MÉTODOS

A. Recolección y preparación de las Muestras

Se tomaron 25 pulpas dentales sanas de niños o jóvenes de ambos sexos, sistemáticamente sanos entre 1 y 18 años, 11 de dientes temporales y 14 de permanentes, cuyos dientes requerían de exodoncia o endodoncia por indicación ortodóntica o procedimientos restauradores.

Las pulpas se obtuvieron en medio aséptico, por medio de sondas barbadas. Cada una se colocó en 1 ml de solución de RPMI y se congeló a -20° C. Una vez recolectadas todas las muestras se descongelaron, pesaron y homogenizaron cada una en 1 ml de una solución de PBS con 1 microlitro de tritón al 0.01% y 2 microlitros de azida de sodio al 0.02%, se centrifugaron y el sobrenadante fue el utilizado para su cuantificación, mediante la técnica de ELISA (Ensayo Inmuno Enzimático en Fase Sólida para Antígenos Solubles).

B. Obtención del Anticuerpo Policlonal contra la colagenasa (Antisuero):

El anticuerpo policlonal, se obtuvo a partir del suero de un conejo hembra previamente inmunizado con colagenasa pura. Se determinó mediante pruebas de “Inmunodott”, basadas en la reacción Antígeno-Anticuerpo, la presencia del anticuerpo contra la colagenasa y se encontró que la dilución óptima del suero era de 1:50.

C. Detección y cuantificación de la colagenasa mediante la técnica de ELISA:

Esta técnica fue escogida por su sensibilidad, confiabilidad, rapidez y costo accesible.

Se montaron 96 pozos de ELISA, colocándose en las dos primeras columnas 100 microlitros por pozo de diluciones seriadas de colagenasa pura a diferentes concentraciones: 1000, 500, 250, 100, 50 y 25 nanogramos.

Como controles negativos se colocaron en algunos pozos, 100 microlitros de una solución preparada macerando la hoja de una planta en PBS. Como blancos /controles sin antígeno) se pusieron 100 microlitros de PBS en otros pozos.

En los pozos restantes se colocaron 100 microlitros del sobrenadante de cada una de las muestras a diferentes diluciones en PBS: Puro, 1:1 y 1:10 (Figura 1).

Diagrama del Montaje en la Prueba de ElisaFigura No. 1.
Diagrama del Montaje en la Prueba de Elisa.

Se colocó luego la solución de suero de conejo de 1:500 que contenía el anticuerpo, para producir la reacción antígeno Anticuerpo, que luego se reveló mediante la colocación de Proteína A marcada con Fosfatasa Alkalina, la cual desarrolló un color al adicionarle Paranitrofenil fosfato como sustrato cromógeno, según el método descrito en el Manual de laboratorio, Instituto Nacional de Cancerología.

El grado de unión del anticuerpo con el antígeno (colagenasa) se evaluó midiendo el color desarrollado, mediante el lector de ELISA a 405 nanómetros. Las absorbancias obtenidas para cada una de las pulpas, tanto temporales como permanentes, pueden verse en la tabla 1.

Tabla 1.
Muestra: Distribución, peso y absorbancia.

TEMPORALESPERMANENTES
NoPeso mgAbsorbanciaNo.Peso mgAbsorbancia
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
21.68
17.49
7.28
7.44
2.05
10.18
5.56
8.2
4.6
6.69
4.11
0.193
1.196
0.276
0.239
0.11
0.461
0.17
0.225
0.045
0.295
0.238
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
7.44
7
54.31
9.92
28.49
38.19
66.62
27.97
39.53
51.01
50.64
33
30.49
1.23
0.097
0.153
0.395
0.702
1.851
2.598
1.968
0.367
0.266
0.244
0.146
0.159
0.058
0.029

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Con el fin de encontrar una función matemática que permitiera estimar al concentración de colagenasa en pulpas de dientes temporales y permanentes, se decidió hacer uso del análisis de regresión, con base en lo observado experimentalmente respecto a la absorbancia que se detectó al utilizar una concentración predeterminada de colagenasa pura.

En una primera instancia y considerando la absorbancia como variable dependiente, se procedió a construir un diagrama de dispersión aportando diferentes consideraciones, para tener una idea visual de su comportamiento. Con base en ésto se pudo asumir el siguiente modelo general:

Y = K – a (1/x)b (Modelo 1)

A continuación, con el fin de estimar la concentración de colagenasa, objetivo principal del estudio, apoyados en la bondad del modelo anterior, se aplicó la función inversa, debido a que la variable dependiente en este caso sería la concentración de colagenasa. El modelo obtenido de esta forma fue:

Y = exp {[-In(k-x) + a]/b} (Modelo 2)

Utilizando el modelo 2, se estimó la colagenasa de cada una de las pulpas a partir de la absorbancia observada y se obtuvo un promedio de 49.02 ng en pulpas de dientes temporales y de 35.72 ng en pulpas de dientes permanentes (Tabla 2).

Tabla No. 2.
Estimación de colagenasa en pulpas.

TEMPORALESPERMANENTES
Peso mgrAbsorbancia mgColagenasa Estimada ngPeso mgAbsorbancia mgColagenasa Estimada ng
2.05
4.11
4.6
5.56
6.69
7.28
7.44
8.2
10.18
17.49
21.68
0.452848
0.579075
0.097826
0.305755
0.440956
0.379121
0.321236
0.27439
0.452848
0.684994
0.089022
59.858
90.64
27.546
41.282
57.873
54.523
42.753
38.548
59.858
144.703
27.138
1.23
7
7.44
9.92
27.97
28.49
30.49
33
38.19
39.53
50.54
51.01
54.31
66.62
0.235772
0.019023
0.048182
0.028831
0.043912
0.067291
0.131212
0.295406
0.680282
0.649702
0.707661
0.072731
0.2118571
0.130376
35.544
24.22
25.369
24.599
25.196
26.171
29.19
40.34
141.294
121.742
163.573
26.406
34.371
26.147
Promedio de absorbancia = 0.378346
D.S. = 0.17852
Promedio Estimado de
Colagenasa = 49.02 ng
Pormedio de absorbancia = 0.237782
D.S. = 2.441
Promedio Estimado de
Colagenasa = 35.72 ng.

Estos valores sugieren la posibilidad de una diferencia entre la cantidad de colagenasa que se encuentra en las pulpas de dientes temporales y la que se encuentra en las pulpas de dientes permanentes, lo cual se evidencia a través de la prueba no paramétrica de Wilcoxon.

RESULTADOS

Según los datos obtenidos, pudo observarse lo siguiente:

En pulpas de dientes temporales.

– No parece existir una relación entre el peso de la pulpa y la cantidad de colagenasa hallada en las diferentes pulpas.

– Con excepción del resultado en dos muestras, no se ven diferencias importantes en la cantidad de colagenasa estimada y en su lugar parece existir una tendencia a una concentración similar (Figura 2).

Estimación de colagenasa en pulpas de temporalesFigura No. 2.
Estimación de colagenasa en pulpas de temporales.

En pulpas de dientes permanentes.

– Tampoco parece existir relación entre el peso pulpar y la cantidad de colagenasa.
– Con excepción de tres de las muestras no parece haber grandes diferencias en la cantidad estimada de la colagenasa y también se observa una tendencia a valores similares (Figura 3).

Estimación de colagenasa en pulpas de permanentesFigura No. 3.
Estimación de colagenasa en pulpas de permanentes.

El promedio de absorbancia y la cantidad de colagenasa estimada, fue mayor en pulpas de dientes temporales, lo cual puede sugerir una diferencia significativa con respecto a la de pulpas de permanentes.

DISCUSIÓN

La colagenasa es una proteína que tiene función catalizadora, es decir de enzimas(20)(21). Algunas enzimas, entre ellas la colagenasa, se sintetizan como precursores inactivos (Procolagenasa). Su activación implica cambios o clivajes, a nivel de las estructuras terciarias de estas proteínas.

Estudios serológicos “In Vitro”, indican que aparentemente no hay grandes diferencias en la estructura molecular entre la Procolagenasa (forma inactiva) y la Colagenasa (forma activa), ya que los anticuerpos contra la colagenasa reconocen igualmente a la Procolagenasa. Esto fue lo observado en el presente estudio pudiéndose pensar que ésta sea la causa, de que si bien se evidenciaron diferencias en la cantidad de colagenasa estimada entre pulpas de dientes temporales y permanentes, dicha diferencia no fue tan marcada como se esperaba.

Es sabido que la colagenasa cumple funciones importantes en el mantenimiento y recambio del colágeno, en condiciones fisiológicamente normales, así como en enfermedad.

Nuevamente, estudios “In vitro”, han mostrado que la pulpa temporal, al colocarla sobre geles de colágeno, presenta una actividad colagenolítica. Esta actividad no se encuentra en pulpas permanentes; este hecho podría indicar la posibilidad de que exista un factor difusible en forma “activa” en la pulpa de los dientes temporales (la colagenasa).

Se puede entonces suponer que la función de la colagenasa no es necesariamente igual en pulpa de dientes temporales que en pulpa de permanentes y que en primer caso puede estar asociada a la reabsorción fisiológica y en el segundo a procesos de renovación y reparación.

Muchas de las reacciones en las células, no transcurren a una velocidad constante, debido a que la actividad catalítica de las enzimas implicadas está regulada de tal manera que la concentración del producto es justamente la necesaria para cubrir los requerimientos de la célula(20).

La actividad de la colagenasa está regulada por proteínas “Inhibitorias) que son glicoproteínas (de 30 kda), o proteínas catiónicas (de 10 kda. Estudios In vitro han demostrado que los fibroblastos sintetizan simultáneamente los inhibidores de la colagenasa y la Procolagenasa. Kishi y otros(17), en un estudio en pulpas de bovinos, demostraron la presencia de inhibidor de la colagenasa producido por las células de la pulpa.

Esto indica que la acción enzimática, tanto desde el punto de vista de “Regulación” como de “Activación” de la colagenasa, tiene un carácter multifactorial. Los resultados obtenidos en nuestro trabajo, en donde se encontraron diferencias en la cantidad de colagenasa estimada en las distintas muestras, pueden significar que existe una variabilidad de la expresión multigénica en la regulación de la actividad enzimática.

Se sabe que los genes están regulados por otros genes (regulación multigénica) y por factores del medio ambiente; estos eventos hacen que el gen de la colagenasa se exprese y por lo tanto se puede suponer que en la absorbancia de los dientes temporales está implicada una relación en la expresión multigénica influída por factores locales y del medio ambiente, como son las fuerzas masticatorias, la presión del germen del permanente y procesos inflamatorios.

CONCLUSIONES

Aunque se evidencia la existencia de una diferencia cuantitativa entre la cantidad de colagenasa estimada entre pulpas de dientes temporales y permanentes, el mecanismo de regulación de la actividad enzimática probablemente no está relacionado únicamente con la cantidad de la enzima, sino con su actividad o inactividad.

Otro factor que debe tenerse en cuenta es que al función de la colagenasa en la pulpa no es igual en ambos tipos de dentición.

Así mismo, la colagenasa es sólo uno de los factores dentro de los múltiples que están involucrados en el proceso de Reabsorción fisiológica de los dientes temporales y éste es variable en la población por su carácter multigénico.

RECOMENDACIONES

Se sugiere:

1. Continuar esta línea de investigación, sobre aspectos de cuantificación de colagenasa en otras muestras de pulpas temporales, por grupos de edad y mediciones de actividad colagenolítica por grupos de edad.

2. Cuantificar colagenasa en dientes temporales con diferentes grados de reabsorción y medir su actividad colagenolítica.

3. Cuantificar colagenasa en pulpas de pacientes sistemáticamente comprometidos.

4. Cuantificar colagenasa en tejido periodontal de dientes con fuerzas ortodónticas.

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