Biología de la Saliva de Parotídea I

Método para la Toma de la Muestra

Doctor: CRISTOBAL CORREDOR R.**

* Universidad Nacional Bogotá. Colombia.
Facultad de Odontología,
Departamento de Medicina Oral y Cirugía.
Laboratorio Biología Celular.
Departamento de Morfología.
Facultad de Medicina. Universidad Nacional.
Bogotá, A.A. 21621 Colombia Tel. 2449948.

Summary

A fine conica1 capilary tubo (0.2-0.5 mm tip In diameter) was obtained using a symetric rhombic distensor with simultaneous electric heating of a 3 cm central portion of teflon tubing, (10 cm long; 2.3 mm in diameter). The tension forces are well adjusted in a simetric way for each type of plastic tubing. Thi fine capilary tube gives us a simple protocol that allows to take parotid saliva under aseptic conditions and to measure the flow rate of saliva secretion.

Resumen

Este trabajo tiene por objeto, presentar una metodología capaz de reducir las alteraciones en la toma de la muestra de saliva parotídea.

Esta técnica permite el control de las presiones hidrostáticas asegurando la medición exacta del flujo; además reduce al máximo los daños mecánicos por sobrepresiones, dilataciones excesivas o abrasión de las paredes del canal cateterizado. La saliva de parótida queda casi estéril lo cual es de suma importancia para estudios de inmunobiología o bioquímica salivar.

Utilizando un extensor simétrico romboidal, acoplado convenientemente a una microforja de temperatura graduable, se han construido catéteres cónicos teflón con punta capilar de 0,2 a 0.5 mm y del diámetro interno máximo de la manguera de teflón utilizado (2,3 mm).

Estos catéteres cónicos (de 5 a 30 cm de longitud), son acoplados ya directamente o por intermedio de una manguera flexible de polietileno, a una pipeta graduada (de 1 a l0 ml). Este conjunto es esterilizado lo cual asegura la asepsia durante la toma de la muestra de saliva. Además de ser desechable.

Introducción

Tanto los estudios biológicos (7, 9, 14) como los sialoquímicos (10) de las secreciones de la cavidad oral exigen un estricto control de las múltiples variables (12), que determinan la rata de secreción espontánea o estimulada lo cual determina ya sea la cantidad o las calidades bioquímicas salivares, en especial sus concentraciones glicoproteicas, (15) actividad enzimática, (11, 17) contenido en azúcares, iones, etc.

Además como requisito mínimo para poder establecer los rangos de variabilidad bioquímica o sialoquímica es indispensable que la toma de la muestra se haga en condiciones óptimas de asepsia, lo cual implica tomar la muestra cateterizando correctamente los canales por los cuales la saliva vierte a la cavidad oral.

Esto implica que se debe evitar causar daños mecánicos por sobrepresión, dilatación excesiva o abrasión en las paredes de los conductos, a fin de evitar extravasación de componentes hematológicos, (5).

Para la cateterización de conductos se debe usar material que sea física y químicamente inerte, libre de agentes patógenos, gases o líquidos adheridos que puedan interferir en la integridad bioquímica o fisicoquímica de los componentes salivares, o causar molestias al donante.

La edad, estados hormonales, hábitos culturales, alimentación, trabajo, biorritmos, características genéticas, etc.

son factores que determinan la calidad de los líquidos de la cavidad oral (10, 15). Estos factores no operan en igual forma para todo tipo de glándula productora de saliva.

Aquí la vía y la clase de estímulos son decisivos (12); por ejemplo al utilizar la estimulación química sobre la lengua, esta posee zonas diferenciables topográficamente, más eficientes para la secreción salivar.

Conocer los rangos de:

variación biológica de la saliva nos ayudan a categorizar mejor los distintos estados fisiológicos glandulares (1, 7, 8, 16) y los fenómenos de interacción de la saliva con la microflora oral, con los alimentos etc..

Tanto en la normalidad como en ciertas patologías como la caries y la enfermedad periodontal entre otras (2, 6, 11, 13).

Metodología

a. Materiales. Para hacer los Capilares Cónicos se eligieron mangueras de teflón (Medical grade, Becton, Dickinson Co, Dupont No. 6434) con un diámetro externo de 3,2 mm y un diámetro interno de 2,3 mm. También se utilizaron mangueras de polietileno de 3,5 mm de diámetro externo para acoplar el catéter cónico, a una pipeta graduada (0,2 – 5,0 ml) Fig. l.

b. Distensor romboidal simétrico. Se diseñó un extensor simétrico de forma romboidal el cual se acopló a una micromufla compuesta por una bobina, (de alambre de ferroníquel, diámetro 1mm), de 3 cm de longitud y de 0,5 de diámetro.

Esta bobina presenta una resistencia de 23 ohmmios y es alimentada con un voltaje ajustable por medio de un reóstato (3 amp), entre 5-15 voltios, según las necesidades de calor para cada material, Fig. 2A, B.

La fuerza mecánica de extensión se genera por la acción combinada de bandas de caucho diagonales y resortes de alambre de acero colocados en los dos extremos simétricos de los brazos del romboide Fig. 2D, E.

Esta tensión se ajusta para cada manguera de teflón según el tiempo y la intensidad de calor suministrado. El extensor romboidal posee un interruptor de la corriente el cual actúa automáticamente, una vez que se ha producido la distensión capilar necesaria.

Este interruptor es ajustable dentro de ciertos límites permitiendo un tiempo óptimo para cada temperatura según el diámetro y espesor de las paredes de la manguera utilizada.

Ajustando una longitud de 10 cm de manguera de teflón con los dos soportes verticales, colocados diagonalmente en el rombo, se aplica la fuerza extensora simétricamente, Fig. 2 C.

Una vez alcanzada la distensión capilar por la acción simultánea de la fuerza y el calor sobre la manguera

Se interrumpe la corriente eléctrica e inmediatamente se enfría la bobina de calentamiento dirigiendo un chorro de aire frío comandado por el mismo interruptor de la corriente, el cual actúa sobre una válvula de paso accionada por un solenoide.

Alternativamente se puede enfriar la bobina soplando aire, con la boca, sobre la bobina de ferroníquel. Una vez obtenido el capilar se libera parcialmente el extremo superior de la manguera lo cual permite que se pueda dividir la zona alargada capilar con una cuchilla dando dos capilares cónicos.

Se vuelve a repetir el proceso sobre una nueva longitud de la manguera. Este material esterilizado posteriormente a 115 °C durante 2 1/2 horas, (calor húmedo).

c. Obtención de la saliva de parótida. Para la toma de la muestra de saliva se utilizaron dos aproximaciones.

1. Directamente utilizando un capilar cónico corto (7 cm) el cual drena libremente a un tubo de ensayo, Fig. 1 B.
2., El capilar cónico acoplado a una pipeta aforada (0,2-l0, ml) siguiendo el método propuesto por el doctor Mier de la Universidad de Heidelberg (11). Tanto los capilares cónicos como las pipetas acopladas se esterilizaron a 115°C durante dos horas, Fig. l

La desembocadura del canal de Stenon se distingue fácilmente por lo cual, haciendo una leve presión con la punta del capilar cónico a la vez que se gira suavemente se consigue introducir de 0,5 a 10 mm dentro del canal. La pipeta graduada se mantiene horizontal a nivel a una distancia controlada tal que permite ver el avance de la secreción salivar.

Una vez que el flujo espontáneo ha comenzado a fluir por la pipeta graduada se toma el tiempo To.

Se espera que la saliva alcance la marca final, (con o sin estimulación), y se anota el tiempo final Tf, Fig.1. En los experimentos con estimulación química de la secreción salivar se procuró aplicar 30 ml de jugo de limón fresco en la zona lingual de máxima respuesta (parte media de los bordes) procurando que la lengua estuviese distendida normalmente.

El aplicador se monta sobre un soporte de teflón ajustable Fig. 2 F. el cual se fija entre los molares superior e inferior, en tal forma que no interfiera en la visualización de la salida del canal de Stenon.

Las muestras de saliva se almacenan congeladas en tubos asépticos de plástico (pitillos transparentes) de 7 cm de longitud, 0,4 cm de diámetro y sellados con una llama de alcohol por ambos extremos.

 

Técnica para Saliva de la Glándula de Parótida, Biología de la Saliva                      Fig. 1. Técnica para la toma de saliva de la glándula de parótida.

La punta fina del capilar cónico “A” se ajusta cuidadosamente al canal de Sternon. La saliva fluye por el capilar cónico y puede gotear en “B” sobre un recipiente calibrado (5-20 ml). Si se requiere la saliva estéril el capilar cónico se acopla con una manguera de plástico L2 y L3 (35 cm) a una pipeta graduada L4 (5-15 ml) la cual termina en una llave D.

El conjunto es esterilizado previamente. Para medir el flujo se abre la llave D y se espera a que la secresión salivar llegue al punto cero (To) de la pipera.

Se explica la estimulación (física, química, psíquica, etc.) Y se registra el tiempo en llenar la pipeta (Tf) si se desea seguir midiendo el flujo se introduce una marca de colorante o aire con la jeringa C y se vuelve a registrar los tiempos To y Tf.

Durante la medición del flujo se debe mantener la altura “h” constante y la pipeta horizontal (a nivel).

Conectando en D un medidor de presión se pueden controlar mejor los parámetros físicos de la secreción.

El flujo se verá afectado por los cambios de dirección, así como por las características superficiales y diámetros de L1, L2, L3 y L4 (18), (Meier 1964, Corredor 1985).

Fig. 2. Fabricación de capilares cónicos combinando simultáneamente la acción distensora simétrica romboidal en dirección vertical, causada por dos fuerzas, (resortes-bandas de caucho diagonales) horizontales y el calor,(micromuflacentral fija). A: vista frontal del extensor romboidal y el reostato. B: micromufla eléctrica. Obsérvese la concentricidad de la manguera plástica. C: manguera distendida sujeta por los extremos. D: vista posterior del extensor; obsérvese el tornillo T que determina la extensión máxima de la zona capilar cónica. La posición correcta de la manguera plástica. Obsérvese la posición de los resortes en los extremos diagonales, cuya fuerza de extensión sobrepasa la elasticidad de la manguera calentada generando la zona capilar cónica. F: soporte aplicador del estimulante químico.

Resultados y Discusión

a. Capilares cónicos. Para la manguera de teflón aquí especificada, aplicando un voltaje de 8-10 voltios sobre la bobina y una fuerza de extensión equivalente a l kg, sobre los brazos opuestos del rombo, se obtuvo un alargamiento capilar cilíndrico de unos 6 cm en un tiempo de 15 a 20 segundos. La fuerza tanto de los resortes como de las bandas de caucho son máximas al comienzo y disminuyen a medida que la distensión capilar aumenta. A su vez el extensor romboidal produce mejor la fuerza distensoria a medida que se va formando el capilar por la mayor eficiencia mecánica del sistema romboidal. Esto favorece que la fuerza ejercida en cada instante sobre el material no sobrepase su coeficiente de elasticidad en las condiciones de temperatura expuestas, permaneciendo el capilar cilíndrico distendido hasta que se enfríe.

La aplicación de la fuerza distensora por el sistema simétrico romboidal asegura que la manguera distendida pase a lo largo del centro geométrico de la bobina de calentamiento recibiendo así calor en forma homogénea, Fig. 2 B. Esto se aprecia en los cortes hechos en la región capilar fina que presentan una sección cilíndrica con paredes de espesores homogéneos.

b. Obtención de la muestra. La cateterización del canal de Stenon es una operación relativamente fácil (H. Maier y IA Born 1984, comunicación personal) dando valores de flujo estimulado entre 0,7-0,1 ml/segundo con jóvenes voluntarios normales (4, 9, 12, 15).

Utilizando técnicas de electroforesis de afinidad (3) (antisuero total), la saliva de parótida de 7 jóvenes voluntarios no presentó variaciones observables en geles de agarosa, Fig. 3. La estimulación de la secreción salivar con jugo de limón, (12) presenta una tendencia a disminuir los arcos de coprecipitación antigénicas, esto se corroboró con las variaciones de la concentración de proteínas utilizando el método de Lowry (4).

En los 7 jóvenes voluntarios no se presentaron molestias de ningún tipo; se debe tener cuidado de no rozar el extremo del capilar con las mucosas orales para evitar posibles contaminaciones de la muestra de la saliva con células o microorganismos existentes en la cavidad oral.

También se debe cuidar de no hacer sobrepresiones sobre el canal ya que esto podría alterar la permeabilidad de las células de las paredes del canal mezclando la muestra con células sanguíneas o biomoléculas plasmáticas, (5, 14).

En experimentos sobre flujo salivar prolongados se debe evitar crear turbulencias cercanas o dentro de la cavidad oral, para evitar cambios en la temperatura, en la humedad o en la población microbiológica, que pudiesen alterar los patrones de estimulación de la saliva. No se recomienda el uso de desinfectantes tópicos. Siendo el flujo salivar un parámetro biofisico muy importante en la fisiología o patología glandular, su estudio debe llevarse a cabo cuidadosamente controlando todos aquellos factores físicos, químicos, o psíquicos que pudiesen alterar especialmente su viscosidad (13, 15, 18).

El control estricto de las presiones hidrostáticas entre la salida del canal de Stenon y el sistema medidor del caudal o flujo salivar podrían ayudar a precisar las variables de secreción salivar.

En este caso la distancia vertical entre el capilar cónico y la pipeta horizontal determinan la presión hidrostática: una distancia vertical entre estos dos componentes muy grande podría ejercer una succión que sobrepase la presión de secreción con el consiguiente colapso del canal dada la naturaleza elástica de sus paredes (19). Si la muestra de saliva no se requiere aséptica el método de goteo directo desde el capilar cónico corto (7 cm) a un tubo de ensayo de otro recipiente graduado podría ser suficiente, Fig. 1 B.

En conclusión los capilares cónicos de teflón obtenidos por el distensor simétrico romboidal aquí descrito, son de óptima calidad y eficiencia para estudiar el flujo de la secreción salivar lo cual asegura la exactitud en la medición de parámetros bioquímicos como la concentración de proteína o presencia de antígenos, (4).

Análisis de proteínas por electroforesis, Biología de la SalivaAnálisis de proteínas por electroforesis, Biología de la Saliva
Fig. 3. Análisis de proteínas por electroforesis en geles de 1% agarosa, amortiguador veronal 0.01 M pH 8,6. A proteínas totales de suero total humano A-1 y de saliva humana A-2,A-3, A-4, A-5 coloreadas con negro-amida inmediatamente después de la separación electroforética. B. Electroinmunodifusión de antígenos séricos B-1 (reacción homologada) y de antígenos salivares B-2, B-3, B-4 y B-5 (reacción heteróloga) detectados por antisueros. En esta reacción heteróloga predominan antígenos de movilidades alta y baja en la mayoría de los individuos analizados.

Agradecimientos

El autor agradece la excelente colaboración de los jóvenes voluntarios de la Facultad de Odontología. En especial a los doctores I. A. Born y H. Maier de la Universidad de Heidelberg Alemania por la sugerencia del trabajo. A los doctores A. Rubiano y E. Vera de la Facultad de Medicina por su apoyo así como al Dr. A. Ortega y personal técnico del Departamento de Física. Al Dr. M. Cabrera de Merck de Colombia y al Dr. C. Gómez de Probiol por la donación de reactivos y antisuero total humano.

Bibliografía

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