Actividad In Vitro de la Azitromicina, Métodos

a) Cepas

Se incluyeron las cepas de Shigella spp. aisladas consecutivamente de niños con enteritis mucosanguinolenta con edad entre 4 meses y 14 años que acudieron a los centros IPS (Asunción, Paraguay) o al Sanatorio San Lucas, así como muestras de pacientes referidos al LACCIM, hasta alcanzar la cifra de 100 aislados.

b) Aislamiento e identificación de las cepas

Las heces fueron obtenidas en forma espontánea en el momento de la admisión del paciente o bien recolectadas por hisopado anal efectuado por un pediatra o una enfermera entrenada. Siempre que fue posible, las heces fueron cultivadas dentro de la hora posterior a su obtención, ya que con ello logramos mayor recuperación; de lo contrario, fueron inoculadas en el medio de transporte Cary Blair por no más de 12 horas

Cuando se sospechó sepsis o bacteremia se tomaron dos muestras de sangre para hemocultivo. Las muestras de heces fueron observadas microscópicamente para enumerar la cantidad de hematíes y leucocitos, y se cultivaron en medio XLD o SS media (Difco USA, Paraguay o Biokar-France, Argentina) y además se enriquecieron en caldo selenito que se incubó por 24 horas y luego se inoculó en los medios sólidos citados.

La identificación de Shigella spp se realizó por metodol ogí a estandarizada artesanal y se confirmó a nivel de especies por métodos serológicos det (Difco-USA en Paraguay o Pasteur – Mérieux – Francia en Argentina).

c) Pruebas de sensibilidad a los antibacterianos

Las puebas de sensibilidad iniciales se realizaron por el método de difusión en agar empleando en Paraguay discos de papel (Difco – USA) y en Argentina tabletas Neosensitabs (Rosco – Denmark), para los siguientes anti-bacterianos: ampicilina (AM); trimetoprima – sulfametoxazol (TS); cefixima (FX); ceftriaxona (CX); furazolidone (FZ) (nitrofurantoín en Paraguay); gentamicina (GE); ciprofloxacina (CI); ácido nalidíxico (NA) y, únicamente en Argentina, fosfomicina (FO).

Todas las cepas, tanto las originarias de Paraguay como las de Argentina fueron ensayadas en CEA para determinar la concentración inhibitoria mínima (CI M) de la fosfomicina por el método de macrodilución en agar con la inclusión de 50 mg/L de glucosa 6-fosfato en el medio.

A todas las cepas resistentes a FX, CX, GE, CI o NA por difusión, les fue determinada la CIM por el método epsilométrico (E-test. AB Biodisk -Suecia). El mismo método se utilizó para determinar la CIM de la AZ. La determinación de la CIM de la AZ se efectuó tanto a p H 7.2 como a pH 8.0 (colónico).

Resultados

Distribución de la Shigella spp en relación al país de origen y a las especies identificadas. Fueron aisladas un total de 100 cepas de Shigella, de las cuales 72 fueron identificadas como pertenecientes al género flexneri y 28 al género sonnei (Tabla 1). De las 100 cepas, 70 fueron aisladas en Paraguay y 30 en Argentina (Tabla 1).

Tabla 1.
Distribución de Shigella spp en relación
al país de origen y a las especies identificadas.

Especies	Paraguay	Argentina	Total
Shigella flexneri Shigella sonnei Totales	49 21 70	23  7 30	72 28 100
Dos cepas de S. flexneri aisladas en Argentina se recuperaron simultaneamente de heces y sangre con el mismo serotipo y antibiotipo.

Número y porcentaje de cepas sensibles determinadas por difusión en agar. Las 72 cepas de Shigella flexneri fueron altamente sensibles a FX, CX, GE, NA, CI y FO, y con altas tasas de resistencia para AM y TS. Las 28 cepas de Shigella sonnei presentaron tasas el evadas de sensibilidad frente a todos los antimicrobianos ensayados, con excepción de TS (Tabla 2).

Tabla 2.
Número y porcentaje de cepas sensibles determinadas
por difusión en agar.

Antibiótico	S. flexneri (n =72)		S. sonnei (n =28)		Totales (%   S)
	(n)	(%S)	(n)	(%S)
AM TS FX SX GE NA CI FO	47 19 70 70 70 68 69 72	34,7 26,4 97,2 97,2 97,2 94,5 95,8 100	3 7 28 28 28 28 28 28	89,5 25 100 100 100 100 100 100	50 26 98 98 98 96 97 100
% S = porcentaje de sensibilidad

Resultados de la CIM para las cepas resistentes por difusión en agar. Las cepas resistentes a FX, Cx y GE correspondieron a cepas de S. flexneri productoras de betalactamasas de espectro extendido CTX-M-2 junto con la betalactamasa de espectro ampliado TEM-1 (G. Gootkind y M. Quinteros). Demostramos que ambas cepas fueron capaces de transferir la resistencia a una cepa aceptora E.coli J53. Las dos cepas de S. flexneri resistentes a CI fueron también resistentes a NA. Las otras 2 cepas resistentes al NA presentaron una CIM de 1mg/L para la CI. Todas las cepas resultaron sensibles a FO con CIM = 64 mg/L (Tabla 3).

Tabla 3.
Resultados de la concentración inhibitoria mínima
(CIM) para las cepas resistentes por difusión en agar.

Antibióticos	N cepas	CIM (mg/L)
FX CX GE NA CI	2 2 2 4 3	64/64 64/128 64/32 >128/>128/>128/64 4/4/16

 
Resultados de las CIM de la azitromicina a diferentes pH. Las cepas de Shigella flexneri presentaron una CIM 50 y CIM 90 de 4 y 6 mg/L a pH 7,2 y de 1,5 y 3 mg/L a pH 8,2.

Las CIM 50 y CIM 90 observadas en las cepas de Shigella sonnei fueron respectivamente 4 y 6 mg/L a pH 7,2 y 1,5 y 3 mg/L a pH 8,2. El 100% de las cepas estudiadas fue sensible a la azitromicina.

Correlación entre los valores de CIM y los resultados de difusión para la azitromicina. Todas las cepas, excepto una de S. flexneri que mostró CIM de 32 mg/l (halo de 11 mm), mostraron halos = 12 mm. Por lo tanto, proponemos este punto de corte provisional para discos o tabletas comerciales de 5 µg de AZ. Estamos realizando estudios con discos de mayor carga para facilitar la discriminación de la sensibilidad de enteropatógenos a la AZ.

Discusión

La S. flexneri demostró ser la especie prevalente de Shigella spp tanto en Asunción, Paraguay como en Buenos Aires, Argentina. En segundo término se aisló la S. sonnei. Durante el período de realización de este estudio no se aisló ninguna cepa de S. boydii ni S. dysenteriae.

Las cepas de S. flexneri mostraron mayor resistencia que las de S. sonnei.

Solamente la AZ y la FO mostraron 100% de sensibilidad en nuestros aislados.

Durante este estudio aislamos dos cepas de S. flexneri productoras de betalactamasa de espectro extendido y por lo tanto resistentes a los betalactámicos ensayados.

Aislamos tres cepas de Shigella resistentes a la CI. La resistencia al NA resultó un buen marcador para sospechar la resistencia a la CI.

La AZ surge como una alternativa promisoria para el tratamiento de la shigelosis considerando la alta sensibilidad a concentraciones fácilmente alcanzables en heces (70), su actividad intracelular, la posibilidad de administrarla en una dosis diaria y su perfil de seguridad. Teniendo en cuenta su larga vida media, hemos iniciado ensayos para determinar la posible efectividad del tratamiento con una única dosis total.

Finalmente, debe tomarse en cuenta que los puntos de corte para la sensibilidad a la AZ no están considerados por NCCLS para bacilos gramnegativos y por otra parte, tampoco se tiene en cuenta su mayor actividad en el pH alcalino que se encuentra en el colon.

Summary

Shigellosis has a very high incidence as acause of enteritis and hospitalization in South American countries. We determinated the in vitro activity of different antimicrobials commonly used for the treatment of paediatric invasive enteritis against 100 consecutive strains of Shigella spp. isolated from children from Asuncion (70) and the Buenos Aires Province (30). All the isolates were obtained from stools presenting leukocytes, red blood cells and/or mucus. S. flexneri accounted for 72% of the isolates and S. sonnei for 28%. No other species of the genera was recovered. Three cases of S. flexneri enteritis ocurred with simultaneous bacteriemia. Two S. flexneri producers of CTX-M-2 ESBLs were detected. Susceptibility to Ampicillin (AM); Trimethroprim-sulfa (TS); Cefixime (FX); Ceftriaxone (CX); Furazolidone (FZ); Gentamicin (GE); Ci profloxacin (CP); Nalidixic acid (NA) and Fosfomycin (FO) were determinated by diffusion with Neosensitab tablets using regression results according to NCCLS M-100-S 9 when available. MICs for azithromycin (AZ) were determined by the E test method in agar Mueller Hinton at pH 7,2 and also at pH 8.2 since lower MIC values for AZ at the formal colonic pH have been observed for enterobacteria (Casella JM et al ICMASK Barcel ona 1998). No important differences in resistance traits were observed among our isolates except for AM (resistance for S. flexneri 65% and for S. sonnei 10%). The susceptibility percentages for diffusion tests were:

AM	TS	FX	CX	FZ	GE	CP	NA	FO
50	26	98	98	100	98	97	96	100

.
Resistance to FX and CX was obser ved among ESBLs producers (MICs>32 mg/l) and the 3 IP resistant strains showed MICs of 4-4 and 16 mg/l. Results of MICs observed against AZ were at pH 7,2: MIC range 0.5-32 mg/l. MIC 90: 6 mg/l. At pH 8,2, MIC range 0,12-4 mg/l. MIC 90: 3 mg/l. This MIC are quite below the levels of AZ expected to be found in the colonic content at normal dosages. In conclusion, clinical trials using AZ for shigellosis treatment should be encouraged considering AZ activity, intracellular and tissue high concentrations, safety and the possibility of short course treatments.

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Correspondencia; Centro de Estudios en Antimicrobianos (CEA).
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