Construcción de una Genoteca de Cdna de Plasmodium Falciparum

Y Búsqueda Posterior del Gen de Calmodulina

Rosalba González Peña*, María Orfa Rojas Rojas**, Moises Wassermann**

* Trabajo de grado presentado para optar el título de Químico.
Departamento de Química. Universidad Nacional de Colombia.
Enfermera, Fundación Santa Fe de Bogotá.
** Grupo de Bioquímica Instituto Nacional de Salud. Bogotá, Colombia.
E-mail: [email protected]

Resumen

Se construyeron dos genotecas de cDNA usando el método de Gubler y Hoffman, la primera partiendo del mRNA del parásito P falciparum, la segunda a partir del RNA total, ambas en estadio de trofozoítos maduros y esquizontes. Se enfatizó en la búsqueda por hibridización de clonos que tuvieran el gen de la calmodulina, proteína mediadora que sirve como receptor intracelular de calcio, regula una variedad de enzimas y posiblemente está relacionada con los procesos de invasión del eritrocito. Se buscaron otros genes de interés de las proteínas miosina y Amasa, también involucradas en el proceso de invasión del eritrocito por el parásito.

Los títulos de las genotecas de cDNA fueron 1,7 x 104 ufp/pg de DNA, a partir de mRNA y 3,4 x l04 ufp/pg de DNA a partir de RNA total. Los rendimientos de la síntesis de primera cadena de cDNA fueron entre 15 y 20% mayores a partir de RNA total que a partir de RNA mensajero (mRNA).

Se obtuvieron trece clonos que hibridizaron con una sonda de calmodulina, dos de la genoteca de cDNA a partir del mRNA y once a partir del RNA total del parásito.

También ocho clonos que hibridizaron con una sonda de miosina, uno de la genoteca de cDNA a partir del mRNA y siete a partir del RNA total del parásito; y cinco clonos que hibridizaron con una sonda de ATPasa, una a partir de la genoteca de cDNA a partir del mRNA y cuatro a partir del RNA total.

Como alternativa para la construcción de genotecas de cDNA, se plantea la uúlización de RNA total como material de partida. Sin embargo, es necesario validar el método en éste y otros organismos.

Palabras clave: genoteca, malaria, cDNA

Abstract

Two cDNA libraries were constructed, using the method proposed by Gubler and Hoffman. For the first one, we started with a representative populítion of mRNA from the F! falapamm. The second one, starts from total RNA; for both libraries we infected erythrocytes with mature trophozoites and schizonts parasite. Emphasis was made in the search of clones by hybridization, containing the gene of calmodulin, which is a mediating protein that serves as intracellular receptor of calcium, regulates a variety of enzymes, and is probably related to the processes of erythrocyte invasion.

Besides, we looked for other genes of interest in myosin and Amase, proteins that are also involved in the process of erythrocyte invasion by the parasite.

The titles of the libraries of cDNA were 1,7 x lo4 upf/ pg of DNA from mRNA, and 3,4 x lo4 upf/pg of DNA from total RNA. The yields of the syntesis of the first strand of cDNA were between 15 and 20% greater from total RNA than from mRNA. Thirteen clones were obtained, which were hybridized with a probe of calmodulin; 2 were taken from the cDNA library from mRNA, and 11 from total RNA. Also 8 clones were hybridized with a probe of myosin, 1 from the cDNA library from mRNA, and 7 from total RNA; in addition 5 clones were hybridized with a probe of ATPase, 1 from the cDNA library from mRNA, and 4 from the total RNA.

Accordmg to the results, the construction of cDNA libraries from total RNA is proposed as an alternate method. It should be of interest to apply it to other organisms in order to test its validtty.

Key words: library, malaria, cDNA

Introducción

El propósito del presente trabajo fue la construcción de una genoteca de cDNA representativa de la mayor población de mensajeros del parásito Plasmodium falciparurn constituyéndose así en un instrumento valioso para la búsqueda, caracterización y expresión de genes del parásito.

Además esta genoteca ofrece la oportunidad de producir proteínas individuales, que son de difícil obtención por extracción directa del parásito.

Se construyeron dos genotecas de cDNA por el método de Gubler y Hoffman; para la primera genoteca se utilizó el RNA mensajero (mRNA) del parásito como material de partida. Para la segunda, se propuso una innovación que consistió en panir del RNA total (mRNA, tRNA y rRNA). Se usaron parásitos en estadio de trofozoítos mhduros y esquizontes. Se compararon los resultados en cuanto a la eficiencia en la conversión de mRNA a cDNA-cs (cDNA complementario de cadena sencilla), eficiencia de clonación y la probabilidad de encontrar secuencias de interés.

Se enfatizó en la búsqueda del gen de la calmodha. Además se buscaron otros genes de interés general en otros proyectos del grupo de Bioquímica del Instituto Nacional de Salud; como el gen de la miosina, y el de la Amasa.

Marco Teórico

La malaria es una enfermedad causada por esporozoarios del orden de Eucoccida, famitia Plasmodüdae, género Plasmoditrm. Existen diferentes especies que infectan al hombre y diversos animales (P. vivax, P. falciparum, P. malarie y P. ovale).

Las dos especies que afectan el hombre son el P. vivax y el P. falcipartrm, de las cuales la especie de mayor virulencia y morbimortalidad la constituye el P. falapartrm. Esta característica y el hecho de que pueda cultivarse in vitro han sido determinantes para elegirlo como modelo de los estudios de investigación en Bioquímica.

Importancia de la calmodulina en parásitos de la malaria

Se ha observado que la calmodulina en el eritrocito regula entre otras funciones la bomba de calcio, manteniendo la concentración libre intracelular de este ion en niveles inferiores de 0,l pM.(‘) Con respecto a la participación de la calmodulina en la interacción hospedero-patógeno, Scheibel y cols. han reportado que los niveles de calmodulina en eritrocitos infectados por el parásito de la malaria en forma de anillos, llegan hasta 17,8+1,1 ngpor lo6 células y en forma de esquizontes llegan hasta 23,3+2,7 ng, comparadas con las células normales (1 1,2I 1,5 ng por 1 O6 células).(‘)

A su vez se ha comprobado que los niveles de esta proteína en el eritrocito infectado son proporcionales a la edad del parásito; localizándose en forma difusa en el citoplasma de los parásitos maduros (trofozoítos y esquizontes) y en el complejo apical del merozoito, desarrollando funciones en el proceso de invasión del eritrocito por el parásito y en los procesos metabólicos y de crecimiento del mismo. Por lo anterior, se hace necesaria la profündización de los estudios genéticos, moleculares y bioquímicos que tienen que ver con la proteína calmodulina y particularmente en los diferentes estadios de infección del glóbulo rojo por el parásito.

Genotecas de cDNA

La información genética transportada por el DNA es usada como plantilla para la síntesis de proteínas, por medio de un intermediario, la molécula de RNA mensajero, mRNA, el cual transporta las instrucciones para la síntesis de proteínas. En las células eucarióticas este proceso ocurre fuera del núcleo, en el ribosoma. Cada polipéptido sintetizado corresponde a una molécula de mRNA. Una célula eucariótica típica tiene alrededor de 10.000 secuencias de mRNA. El P h moditm falciparum, tiene alrededor de 2000 a 5000 especies diferentes de mRNA.(2)

Una estrategia hacia el aislamiento de un gen eucariótico particular, consiste en sintetizar el DNA complementario (cDNA) correspondiente al mRNA de interés (clon de cDNA).

Una genoteca de cDNA o banco genético, debe representar la mayor población de mensajeros y es construida a partir del mRNA. Las secuencias de interés, pueden seridentificadas por hibridización con sondas de oligonucleótidos, sondas de anticuerpos o de cDNA o de mRNA. La metodología de construcción de la genoteca se describirá más adelante.

Vectores de clonación

Dado que un clono es una población grande de moléculas, bacterias o células idénticas que surgen de un ancestro común, se uuliza la clonación como un medio que permite la producción de un número grande de moléculas idénticas de DNA, en este caso copias de cDNA, que codifican para genes de la mayor parte de proteínas de un genoma, particularmente del P. falciparum.

Una vez lograda la clonación, un dono particular que codifique para un gen de interés, puede ser identificado, aislado y caracterizado. Dicho proceso comienza una vez sintetizado el cDNA de cadena doble, cDNA-cd, en donde se utiliza un vector de clonación como vehículo al cual se le inserta el cDNA, vector que posteriormente infecta una bacteria de una cepa seleccionada y permite la replicación del cDNA.; finalmente se hace la selección de los clonos llamados recombinantes.

En el presente trabajo se utilizó un vector fago Agti i , el c d favorece la expresión eficiente del DNA en el hospedero (bacterias, E. coli); con un rendimiento alrededor de 1O4 fagos x ng de DNA vector.

Material y  Métodos

Inicialmente se cultiva y se sincroniza el Plasmoditrm faicipamq con el ánimo de que todos los parásitos estén en el mismo estadio de madurez, a partir de esto se aisla el RNA total que contiene las tres poblaciones de RNA, es decir RNA ribosomal (rRNA), RNA de transferencia (tRNA) y RNA mensajero (mRNA).(3)

De allí se hace la separación de mRNA que tiene una cola poli A en su extremo 3′; por medio de una cromatografía de afinidad que tiene en su matriz un extremo oligo dT; de este modo, al pasar el mRNA por la columna el extremo poliadenilado del mRNA, éste se une a la matriz, dejando salir el rRNA y el tRNA. Luego el mRNA se eluye de la columna por tratamientos fisicoquímicos. (Figura 1)

Una vez se tiene el mRNA, éste se utiliza como plantiila para la síntesis del cDNA de cadena senda, cDNA-cs; a partir de la enzima transcriptasa inversa del virus de mieloblastosis aviar. Se usa una cadena corta de olgo dT, la cual se anilla con la cola poltA del mRNA y sirve como iniciador de la síntesis del cDNA. Hasta aquí se obtiene un híbrido mRNA-cDNA, de donde el cDNA se separa del mRNA plantilla por desnaturalización en caliente.

Luego sobre la primera cadena de cDNA (cDNA-cs) se sintetiza la segunda cadena de cDNA (cDNA-cd), utilizando la enzima E. coli DNA polimerasa 1, usando el extremo 3′ de la primera cadena como iniciador. Se adicionan grupos metilo (-CHJ al cDNA para evitar que éste sea cortado en los sitios internos por las enzimas de restricción. Se utilizan enzimas de restricción para hacer muescas o cortes en los extremos de las secuencias de cDNA, permitiendo así la adición de brazos o adaptadores, que facilitan su unión al DNA del vector de clonación seleccionado, el fago A g t l 1. (Figura 2)

Separación de cromatografía

Figura 1. Separación de mRNA poliA por cromatografía de afinidad

Al vector de clonación, se le coloca una cubierta o capside y cola proteica, este proceso se denomina empaquetamiento y constituye el equivalente a fabricar un virion infeccioso. Finalmente, con el virion infeccioso, se infectan bacterias E. coli competentes previamente seleccionadas.

Estas bacterias tienen la maquinaria genética y molecular capaz de multiplicar y expresar los insertos de cDNA del parásito. A su vez estas bacterias poseen mutaciones que permiten diferenciar las bacterias que tienen DNA recombinante de las que no, las primeras dan origen a placas blancas o huecos en los sistemas de cultivo (denominadas unidades formadoras de placa, upf) y las segundas dan origen a colonias azules. En este punto, si la clonación resulta exitosa, se considera construda la genoteca de cDNA.

Posteriormente, se hace el rastreo por hbridización de las secuencias de interés, para el caso de los genes de calmodulina, miosina y ATPasa; sobre las placas de fago. De otro lado, para el caso de la segunda genoteca, el cDNA se sintetizó utilizando como planda el RNA total, es decir, sin hacer la separación previa del mRNA.

Es de anotar que no se ha reportado ningún trabajo en donde se ensaye la transcripción inversa sobre la planda de RNA total en P. falciparum

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