Metodología
Toma y procesamiento de muestras:
Área de estudio. Este proyecto fue desarrollado en la Costa Caribe colombiana en el departamento de Bolívar. Tomando un total de treinta y siete (37) biopsias de cérvix de pacientes que acuden a la Unidad de Patología Cervical y Colposcopia de la de la Clínica Maternidad Rafael Calvo. Durante el periodo comprendido entre enero de 2006– enero de 2008.
criterio de inclusión de Colposcopia y Biopsia de Cérvix
El criterio de inclusión eran mujeres con citología anormal, a quienes se les realizó Colposcopia y Biopsia de Cérvix dirigida cuyo estudio histológico reportó Lie de Bajo Grado o Alto grado.
Toma de biopsias:
Las biopsias fueron obtenidas bajo visión colposcópica. Las muestras de las pacientes fueron registradas y enumeradas de acuerdo a protocolos de laboratorio.
Para la recolección de las biopsias de las pacientes, este proyecto siguió lo estipulado en el Artículo 11 de la Resolución No. 008430 de 1993 Consentimiento Informado, de acuerdo con el formato por escrito, del sujeto de investigación, o su representante legal, con las excepciones dispuestas en dicha resolución y siguiendo de manera estricta los lineamientos contemplados en el Protocolo de Helsinki.
Todas las pacientes del estudio fueron sometidas a un formulario encuesta, parte integral del estudio.
A las pacientes con citología anormal se les practicó colposcopia y las muestras de tejido obtenidas por biopsia se conservaron en formol tamponado y después se incluyeron en parafina. Posteriormente se practicaron cortes 4 micras y tinción con Hematoxilina y Eosina para evaluación y diagnóstico por patólogos institucionales.
Inmunohistoquímica:
Los cortes de 4μ se desparafinaron y se les practicó recuperación antigénica con el target retrieval y la Cámara de Pascal, tratamiento con anticuerpo primario anti-p16, dilución 1:20, (Clone E6H4, Dako Cytomation), anticuerpo secundario biotinizado, streptavidina, Cromógeno: 1 ml de Buffer sustrato mas una gota de diaminobencidina, utilizando la técnica de Dako Cytomation, la cual colorea con rapé al marcador aumentado en concentración. Luego se analizaron las placas acorde con los parámetros de Klaes y Sano (8,33).
Análisis estadístico:
Los datos fueron almacenados y posteriormente analizados en el paquete estadístico SPSS 12.0. Se utilizó la prueba X2 para comprobar la relación entre las pruebas citológicas, colposcópica e histológicas.
Resultados
Características de la población del estudio: el 69% de las pacientes estaban entre 21 y 45 años, sólo el 10% estaba entre 15 y 20 años y el 21% eran mayores de 46 años.
Citología, colposcopia y biopsia de Cérvix
Resultados a la citología, colposcopia y biopsia de Cérvix al analizar los resultados de la colposcopia, teniendo como prueba de referencia a la biopsia, de 7 lesiones de alto grado diagnosticadas por la colposcopia de ellas fueron diagnosticadas en el mismo sentido por la biopsia.
Asimismo, de las 29 lesiones de bajo grado diagnosticadas por la colposcopia, 9 de ellas fueron clasificadas por la biopsia como lesiones de alto grado (31%). Mientras que 2 LIE de bajo grado habían sido diagnosticadas como cervicitis, por su aspecto a la colposcopia.
Ver Tabla Nº 1.
Las citologías reportaron: ASC-US 7(17,9%), ASC-H 1(2,6%), AGUS 1 (2,6%), LIEBG 23 (59%), LIEAG 7 (17.9%). Los diagnósticos colposcópicos fueron: cervicitis 2 (5,1%), lesión oculta 1(2,6%), LIEBG 29 (74,4%), LIEAG 7 (17,9%). Las biopsias reportaron: LIEBG 23 (59%) y LIEAG 16 (41%). Ver tabla 4.
Análisis inmunohistoquímico:
veinticuatro (24) biopsias de las 37, fueron positivos al marcador p16INK4a, distribuidos así: El 45,5% de las LIEBG y el 93,3% de las LIEAG.
En 14/15 de las LIEAG, hubo correlación estadística significativa entre la positividad del marcador y el diagnostico con Hematoxilina & Eosina, cuando p≥0,05. La mitad de las lesiones de bajo grado presentaron positividad al marcador (45.5%)
Tabla Nº 2.
Dentro de los patrones de expresión del marcador p16INK4a (8,33), se obtuvieron diversos patrones de lectura.
Lea También: Lesiones Intraepiteliales Escamosas Cervicales: Conclusión
Tabla Nº 3
El 64.86%, de los pacientes reportados como LIE de bajo grado o LIE de alto grado, dieron positivos para p16INK4a.
La positividad del p16INK4a para los pacientes de LIE de alto grado, confirma el papel del p16INK4a como marcador de progresión. Se encontró asociación entre los resultados de la biopsia y la prueba inmunohistoquímica (X2 =6.17, p<0,05).
La Figura Nº 1 presenta fotografías microscópicas de lesiones intraepiteliales negativas y positivas para p16INK4a y coloración hematoxilina eosina.
Este es el primer estudio de investigación descriptivo, realizado en el departamento de Bolívar, para establecer la presencia del marcador de p16INK4a, por técnicas inmunohistoquímicas, en lesiones intraepiteliales del cérvix como herramienta útil en el pronóstico de lesiones intraepiteliales.
La comunidad presenta los factores de riesgo que pueden conducir a la contaminación con VPH-AR y a la aparición de LIEBG, LIEAG y su posterior evolución a cáncer cérvico-uterino. (37,38,39,40,41,42,43,44)
Al igual que lo que se reporta en la literatura y de acuerdo a la historia natural del Virus del Papiloma humano, observamos que las pacientes menores de 20 años presentaron sólo LIEBG, mientras que los LIEAG se presentaron en pacientes mayores.
El 64.86%, de las pacientes reportados como LIE de bajo grado o LIE de alto grado, dieron positivos para p16INK4a, es decir ya contenía células con transformación tumoral y por consiguiente su detección es muy temprana, tiempo de ganancia terapéutica.
El alto porcentaje de positividad al p16INK4a para los pacientes con de LIE de alto grado, nos muestra concordancia en el hallazgo y confirma el papel del p16INK4a como marcador de progresión. Se encontró asociación entre los resultados de la biopsia y la prueba inmunohistoquímica (X2 =6.17, p<0,05).
Las LIEAG deben tratarse como tal y no son motivo de conducta expectante. Hubo un caso con p16 negativo. Se sabe que hay un porcentaje de LIEAG que presentan regresión espontánea, en teoría, éstas deberían tener el p16INK4a negativo.
El p16INK4a negativo o positivo en LIEAG serviría para determinar que lesiones tienen mayor riesgo de recidiva y de esta manera marcar el pronóstico para la curación definitiva.
La colposcopia, como método de apoyo diagnóstico:
representa un paso fundamental en el estudio de toda paciente con reporte de citología anormal. La lesión oculta a la colposocopia pone de manifiesto que la citología y la colposcopia, son pruebas complementarias y no excluyentes.
Efectivamente cuando comparamos las diferentes metodologías, como citología versus biopsia, el nivel de concordancia es mayor. Para las lesiones de alto grado, como se ha reportado en la literatura mundial (43,44,45,46,47).
El diagnóstico definitivo y requisito indispensable para establecer un tratamiento, es el estudio histopatológico (48).
En el presente estudio podría sugerir que la positividad al p16INK4a se asocia con progresión en algunos casos de LIEBG (39,49). Ya que se observó alta correlación entre el grado de displasia y el nivel de expresión del p16INK4a, como se aprecia en otros estudios (50).
En el caso de LIEAG, con p16INK4a negativo, corresponde a una paciente cuyo diagnóstico histológico con Hematoxilina –Eosina fue dudoso entre una cervicitis atrófica severa y una lesión de alto grado. Demostrando en este caso la utilidad de este marcador en lesiones morfológicamente similares y de difícil diagnóstico (54,55)
Estudios realizados por algunos autores, apoyan el uso rutinario de la evaluación immunohistoquimica del p16INK4a:
De los especímenes cervicales obtenidos con biopsia para una discriminación mejor de lesiones (51).
Es importante decir que como todas las proteínas reguladoras del ciclo celular, el papel como ayuda diagnóstica del p16INK4a es limitado (52) y faltan más evidencias. Quizá por mucho tiempo seguirá siendo la prueba histológica (H-E) la prueba diagnóstica para las lesiones intraepiteliales escamosas cervicales.
Sin embargo se propone fuertemente la detección inmunohistoquímica de p16INK4a como un complemento a los análisis histopatológicos con H-E, de manera similar a lo reportado (53). Su uso sería de gran utilidad en diferenciar lesiones que simulen displasia y como una herramienta de alto valor para el pronóstico de las lesiones premalignas.
Es necesario realizar nuevos estudios con detección molecular del VPH asociado a la presencia o ausencia de positividad del marcador. Hacerlo en poblaciones más grandes y evaluar su valor predictor de progresión en estudios de seguimiento.
