Los Linfocitos T CD8+ en la Respuesta Inmune Celular

¿Cómo Funcionan?, ¿Cómo se Evalúan?

John Mario González MD. Ph.D., Anilza Bonelo M.Sc
Candidata Ph.D., Myriam Arévalo B.Sc., Candidata Ph.D. y Sócrates Herrera MD.

Los conocimientos generados en el campo de la función y la actividad de los linfocitos T CD8+ al igual que en la caracterización de las moléculas del Complejo Mayor de Histcompatibilidad han sido parte fundamental para determinar los mecanismos inmunes celulares que actúan en el control de procesos infecciosos y tumorales.

Los linfocitos T CD8+ tienen la capacidad de reconocer antígenos presentados por las moléculas del clase I en la superficie de las células.

Una vez el antígeno es reconocido por los linfocitos, se inicia una serie de vías de activación en el linfocito que llevan finalmente a la eliminación de la célula blanco mediante mecanismos como citotoxicidad directa o la inducción de muerte celular programada.

Respuesta celular mediada por los linfocitos T CD8+

En este artículo se revisan los principales aspectos de la respuesta celular mediada por los linfocitos T CD8+ que permiten su identificación mediante técnicas de laboratorio como la prueba de liberación de cromio y la determinación de citocinas mediante ELISPOT.

Introducción

La respuesta inmune adquirida o específica es mediada por dos tipos de moléculas receptoras: las inmunoglobulinas (Ig) en la superficie de los linfocitos B y el receptor de celulas T (RCT) en los linfocitos T. A diferencia de las Ig que reconocen antígenos solubles, el RCT reconoce sólo antígenos presentados en el contexto de las moléculas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CMH) MACROAUTO ENRef (1).

De esta forma, los linfocitos T (LT) pueden detectar patógenos intracelulares al reconocer fragmentos de antígenos derivados del microorganismo en la superficie de la célula infectada.

Los linfocitos T CD8+ MACROAUTO ENRef

Los patógenos como los virus y algunas bacterias que se replican en el citosol, son reconocidos y eliminados por los linfocitos T CD8+ MACROAUTO ENRef (2). Los patógenos que viven en vesículas como bacterias y parásitos son reconocidos por los linfocitos T CD4+ MACROAUTO ENRef (3).

En este artículo se revisarán los conceptos generales de los principales participantes en la respuesta inmune mediada por los linfocitos citotóxicos (LCT).

Finalmente se revisarán los sistemas de evaluación para la función de la respuesta de LCTs con énfasis en las pruebas basadas en la citotoxicidad y la producción específica de citocinas.

Moléculas de clase I del CMH y presentación de péptidos

El estudio de las moléculas de clase I del CMH por medio de cristalografia de rayos X, ha permitido no sólo hacer aproximaciones a su estructura sino también a conocer aspectos funcionales MACROAUTO ENRef (4, 5).

Las moléculas de clase I están conformadas por una cadena (codificada en el cromosoma 6 humano y por la (2 microglobulina. La cadena (presenta tres dominios funcionales, los dominios (1 y 2) que forman la hendidura donde se une el péptido y el dominio (3 forma la región parecida a la inmunoglobulina MACROAUTO ENRef (1).

La (2 microglobulina se une de forma no covalente a la cadena ( y le brinda estabilidad a la molécula de clase I antes de que se una el péptido antigénico MACRO-AUTO ENRef (6), Figura 1.

Presentación de antígenos al linfocito T CD8+

Figura 1. Presentación de antígenos al linfocito T CD8+. La célula presentadora de antígeno, procesa y presenta el antígeno en el contexto de las moléculas de clase I. Una vez reconocido el antígeno se activa el linfocito T y se disparan los mecanismos de acción. RCT: receptor de células T, CMH: complejo mayor de histocompatibilidad, FasL: ligando de la molécula Fas.

Actualmente, es posible determinar las características de los péptidos que potencialmente se unen a ciertas moléculas de clase I.

En las moléculas de clase I, la hendidura de unión al péptido sólo reciben antígenos de 9 a 10 aminoácidos, algunos de estos residuos tienen la capacidad de insertarse en una especie de bolsillos formados en la base de la hendidura del las moléculas del CMH.

Estos residuos que son los realmente encargados de la unión péptido/CMH reciben el nombre de motivos o secuencias de anclaje MACROAUTO ENRef (7-9). La secuencia potencial de unión de los péptidos a la molécula de clase I HLA-A*0201 es mostrada de forma esquemática en la Figura 2.

Esquema que representa los residuos del péptido

Figura 2. Esquema que representa los residuos del péptido (aminoácidos en posición 2 y posición 9) que se unen a la molécula de clase I HLA-A*0201. Los aminoácidos están re-presentados por el código de una letra: L, Leucina; M, Metionina; V, Valina.

Antes de unirse a las moléculas recién sintetizadas en el retículo endoplásmico, los péptidos de tamaño adecuado son generados en el citosol por medio del denominado “procesamiento antigénico”, tal es el caso de antígenos virales y tumorales MACROAUTO ENRef (10).

Las proteínas en el citosol sufren un procesamiento enzimático por medio de una organela denominada proteasoma MACROAUTO ENRef (11). El proteasoma está compuesto por diversas subunidades, dos de las cuales, denominadas LMP-2 y LMP-7, son codificados por genes localizados en el loci del CMH en el cromosoma 6 MACROAUTO ENRef (12). La expresión de estos genes puede ser inducida por el interferón gama (IFN-().

La incorporación de estas subunidades al proteasoma está asociada con la especificidad del corte en los péptidos gene-rados que se ensamblarán junto con las moléculas de clase I MACROAUTO ENRef (13).

Una vez los péptidos son generados, son transportados del citosol a la luz del retículo endoplásmico. Dos moléculas denominadas transportadores,

TAP-1 y TAP-2, y codificados igualmente en el loci de los genes CMH, funcionan como medio de transporte para los péptidos MACROAUTO ENRef (11, 14).

De forma más reciente, se ha determinado que una nueva molécula, denominada tapaisina, se asocia a las proteínas TAP para ayudar a la traslocación del péptido al retículo MACROAUTO ENRef (15, 16).

Una vez dentro del retículo endoplásmico, la molécula de clase I recién sintetizada estabilizada por chape-ronas y por la (2 microglobulina, recibe el péptido y continúa su ruta hacia la superficie celular MACROAUTO ENRef (11), MACROAUTO ENRef (10).

Los principales pasos de la vía de procesamiento de clase I son representados en la Figura 3.

Retículo endoplasmático

Figura 3. Representación de los principales pasos en la vía de procesamiento de los antígenos presentados por las moléculas de clase I. Una vez el péptido ha sido producido, transportado y ensamblado con la molécula de clase I, el complejo péptido/CMH continúa su ruta hacia la superficie de la célula.

Los linfocitos T CD8+

La inmunidad posee un sistema de reconocimiento específico de antígenos producidos dentro de la célula hospedera como el caso de las infecciones virales, algunas infecciones bacterianas y parasitarias y también en antígenos producto del cambio neoplásico de las células.

Dicho sistema de reconocimiento es mediado por los Linfocitos T CD8+ (LT CD8+) que censan la superficie de la células nucleadas mediante su RCT en busca de antígenos presentados por las moléculas de clase I del CMH.

Los Linfocitos T CD8+ (LT CD8+) vírgenes una vez activados, se diferencian en LCTs. En dicho proceso de activación no solo participa el reconocimiento del antígeno sino también señales coestimulatorias que dependen de la célula blanco de ataque o Célula Presentadoras de Antígeno (CPA) MACROAUTO ENRef (17).

Una vez activado el LCT se generan una serie de mecanismos efectores encaminados a la destrucción de la célula infectada o tumoral MACROAUTO ENRef (18), Figura 1.

El principal mecanismo efector de los LT CD8+ es la citotoxicidad donde mediante exocitosis se liberan sustancias almacenadas en los de gránulos pre-formados.

Estos granulos contienen proteínas como la perforina y las granzimas o fragmentinas MACROAUTO ENRef (19, 20). La perforina, la cual presenta una alta homología y actúa de forma similar al factor C9 del complemento, se polimeriza en la membrana biológica de la célula blanco generando poros que permiten el paso de agua y electrolitos, induciendo lísis osmótica MACROAUTO ENRef (21, 22).

Las granzimas son proteínas pertenecientes a la familia de proteasas de serina.

Estas enzimas, que entran a la célula a través de los poros formados en la membrana por la perforina, tienen la capacidad de inducir la muerte celular mediante la fragmentación del ADN de las células blanco, probablemente induciendo el mecanismo de la apoptosis MACROAUTO ENRef (23).

Otro mecanismo de muerte celular no dependiente de perforina involucra la interacción entre la molécula Fas (CD95) y su ligando del Fas (FasL). Esta última molécula se expresa en la superficie de los LT CD8+.

La interacción Fas/FasL induce en la célula blanco la muerte celular programada mediante la apoptosis MACROAUTO ENRef (18, 22, 24).

Finalmente los LCTs activados producen de forma específica citocinas como IFN-(y el factor de necrosis tumoral alfa (FNT-() MACROAUTO ENRef (25).

Estas citocinas contribuyen al sistema de defensa incrementando la expresión de moléculas del CMH, aumentando el transporte de péptidos que se unen al CMH e induciendo al producción de óxido nítrico MACROAUTO ENRef (1).

Todas estas propiedades del los LCTs pueden ser utilizadas para detectar la presencia de LT específicos de antígeno y para determinar la frecuencia de estos en sangre periférica

Evaluación de la respuesta inmune mediada por los linfocitos T CD8+

Múltiples técnicas han sido utilizadas para la evaluación de los LT CD8+. Dentro de estas técnicas se encuentran:

a) la prueba de citotoxicidad por liberación de cromio MACROAUTO ENRef (26), b) la valoración de citocinas por ELISPOT MACROAUTO ENRef (27), c) la tinción intracelular de citocinas mediante citometría de flujo MACROAUTO ENRef (28), d) la secuenciación del RCT MACROAUTO ENRef (29, 30) y de forma mas reciente e) la producción de tetrámeros solubles de clase I del CMH MACROAUTO ENRef (31, 32).

Esta revisión se enfocará en las dos primeras técnicas descritas las cuales son de uso común en nuestro laboratorio.

1. Prueba de citotoxicidad por liberación de cromio

Esta prueba de citotoxicidad descrita hace ya más de dos décadas ha sido la técnica de mayor uso para la determinación de LT CD8+ específicos de antígeno MACROAUTO ENRef (26).

Sin embargo su limitada sensibilidad y el uso de un isótopo radiactivo como el 51 Cr, han influenciado la búsqueda de nuevos métodos para su remplazo, aunque la prueba sigue siendo de gran utilidad.

El principio básico de la prueba de citotoxicidad radica en la capacidad de los LTCs de lisar la célula blanco mediante la liberación de perforina MACROAUTO ENRef (22).

De un lado, se cuenta con las células efectoras (LT CD8+) que reconocen de forma especifica un antígeno presentado en el contexto de las moléculas de clase I del CMH, y del otro lado se cuenta con la célula blanco que puede estar infectada por un virus o una célula tumoral, en ambos casos los antígenos procesados por la vía de clase I, son expresados en la superficie de esta CPA MACROAUTO ENRef (33).

Sin embargo una CPA puede ser pulsada con péptidos sintéticos que representen la secuencia del antígeno que se quiera estudiar, Figura 4. Con posterioridad la CPA ha sido marcada con 51 Cr, isótopo que se usa como el revelador de la prueba.

Prueba de citotoxicidad por liberación de cromio

Figura 4. Prueba de liberación de cromio. La célula blanco que a su vez presenta el antígeno esta marcada con cromio. Una vez el complejo peptido/CMH es reconocido por la célula efectora (linfocito T CD8+) se induce la lísis mediada por perforina con la liberación del 51Cr al medio. El sobrenadante es recuperado y leído en un contador gama, el resultado se obtiene en cuentas por minuto (cpm).

Ambos tipos de células, efectora y blanco son incubadas juntas por un periodo de 4 a 6 horas, tiempo en el cual si el LCT reconoce el antígeno se induce la liberación de perforina y la posterior lísis de la célula blanco que permite la salida del 51 Cr, de tal forma que la cantidad de 51 Cr en el sobrenadante es proporcional a la actividad citotóxica presente en el cultivo.

La Figura 5 muestra la curva típica de una prueba de liberación de cromio con células humanas especificas de un péptido sintético proveniente de la proteína de matriz del virus de la influenza (MP flu a.a. 58-66) restringido a la molécula de clase I HLA-A*0201 MACROAUTO ENRef (34).

Prueba de liberación de cromio con linfocitos T CD8+ humanos

Figura 5. Prueba de liberación de cromio con linfocitos T CD8+ humanos. En el eje Y se encuentra el porcentaje de lísis y en el eje X el radio entre las células efectoras y las células blanco iniciando (1000:1). Células blanco (CPA) pulsadas con el péptido MP flu (() y células no pulsadas con péptido (() utilizadas como el control negativo de la prueba. Radio E:B, relación entre el número de células efectoras y células blanco.Una de las desventajas de la prueba de liberación de cromio es que el resultado obtenido nos indica la presencia de citotoxicidad de una forma cuantitativa.

Si se desea obtener la frecuencia de LCTs específicos de antígeno, se deberá realizar la denominada Prueba de Dilución Limite (LDA en ingles), prueba dispendiosa y de altos costos MACROAUTO ENRef (41).

2. Valoración de citocinas por ELISPOT

Mediante la técnica de ELISPOT (enzyme-linked immunospot) se evalúa la producción de citocinas por parte de una célula activada, lo que permite no sólo su detección sino también contar cada célula, obteniendo así la frecuencia de LT específicos de antígeno MACROAUTO ENRef (27).

El principio básico del ELISPOT es la captura de una citocina mediante dos anticuerpos en un procedimiento similar a la técnica de ELISA. Para tal fin se utilizan placas de 96 pozos con el fondo recubierto con papel de nitrocelulosa en el que se pega el primer anticuerpo monoclonal especifico de la citocina a medir.

Seguidamente se depositan las células (LCTs) frescas o previamente estimuladas in vitro, las cuales producirán citocinas (IFN-(y TNF-() MACROAUTO ENRef (35, 36).

Posteriormente se adiciona un segundo anticuerpo monoclonal marcado con una enzima que permite el revelado de la prueba por medio de la adición de un substrato, Figura 6. Los puntos (del ingles spots) obtenidos, reflejan la producción de citocinas y son las huellas dejadas por los LCTs especifico de antígeno activados.

Prueba de ELISPOT

Figura 6. estudiar es capturada en medio de dos anticuerpos Prueba de ELISPOT. La citocina a monoclonales, la presencia de los puntos indica que en ese sitio una célula produjo citocina en respuesta a un estimulo antigénico. En la figura inferior se muestra el resultado de un ELISPOT para IFN-?? en linfocitos T CD8+ específicos del virus de la influenza.

El resultado (número de spots) se obtiene de contar los puntos por medio de un estereoscopio y la frecuencia se obtiene de relacionar el número de ellos con le número de células efectoras incubadas en cada pozo.

Aunque se puede presentar variabilidad en el tamaño y en la intensidad de los puntos, la valoración visual es adecuada. En la actualidad se cuentan con equipos de conteo automático asistidos por vídeo MACROAUTO ENRef (37).

En la parte inferior de la figura 6, se muestra el resultado de un ELISPOT utilizando LT CD8+ purificados mediante selección positiva utilizando perlas magnéticas cubiertas con un monoclonal anti-CD8+. Los linfocitos fueron estimulados en presencia del péptido MP flu.

Esta técnica del ELISPOT ha sido utilizada con éxito en la evaluación de la frecuencia de LCT en enfermedades infecciosas virales como influenza MACROAUTO ENRef (38) y SIDA MACROAUTO ENRef (39, 40) y en enfermedades tumorales como el melanoma MACROAUTO ENRef (36).

Se considera que el ELISPOT es 30 a 100 veces mas sensible que la prueba de liberación de cromio MACROAUTO ENRef (41).

Conclusiones

Nuevas técnicas han sido desarrolladas para la evaluación y el monitoreo de la respuesta inmune mediada por los LC CD8+, sin embargo las técnicas discutidas en este artículo: prueba liberación de cromio y el ELISPOT, son de amplia uso debido a su especificidad y facilidad de aplicación en la investigación básica y clínica realizada en nuestro medio.

Agradecimientos

Los autores agradecen a los doctores J.A. López y G. Corradin del Instituto de Bioquímica de la Universidad de Lausana, Suiza y a G. Quintero M.V. del Instituto de Inmunología del Valle por la corrección del manuscrito. A. Bonelo y M. Arévalo son becarias de COLCIENCIAS.

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