Medicina, Estudio Longitudinal en Pacientes de un Area Endémica para Enfermedad de Chagas

(Tibú, Norte de Santander)

F. GuhU, L. Hudson2, F. Serpa3, N. de SánchezI, D. Bridge2, C. JaramilloI y A. Young2

Resumen

Dos grupos de pacientes fueron examinados para la presencia de anticuerpos anti-Trypanosoma cruzi por inmunofluorescencia y ELISA, (i) habitantes de la población y del área rural circundante de Tibú, Norte de Santander (n = 327) Y(ii) empleados de la Empresa Colombiana de Petróleos (ECOPETROL n = 849). El segundo grupo presentaba una rata menor de serología positiva (12% comparado con 29%), pero las distribuciones de los títulos de anticuerpos fueron muy similares en los dos grupos. Un total de 119 muestras séricas (37 de la población y 82 de ECOPETROL, incluyendo 25 controles seronegativos) fueron analizados en su capacidad de inmunoprecipitar los 7 polipéptidos mayores de tripomastigotes de T. cruzi de Mr mayor de 72 kDa. Aunque 10 sueros de pacientes positivos no mostraron inmunoprecipitación, todos los sueros positivos restantes contenían anticuerpos que reaccionaban con los polipéptidos de 150, 90 y 85 kDa.

Cuando los sueros positivos para T. cruzi en inmunofluorescencia y negativos por inmunoprecipitación se probaron por ELISA usando GP90, todos fueron negativos, sugiriendo que los pacientes habían tenido una infección por T. rangeli que había sido erróneamente diagnosticada. El nuevo diagnóstico fue confirmado por inmunofluorescencia y ELISA con epimastigotes de T. rangeli. Se realizaron estudios longitudinales en 19 pacientes del grupo de ECOPETROL durante 3.5 años.

Cinco pacientes seropositivos mostraron un cambio en sus perfiles de inmunoprecipitación anti-tripomastigote en este período; uno por pérdida de la precipitación de una banda de alto peso molecular previamente reconocida y otros cuatro por conversión de un perfil negativo a uno positivo de inmunoprecipitación. Estos últimos pacientes presentaron inicialmente una infección no complicada de T. rangeli pero luego adquirieron una superinfección por T. cruzi. Estos pacientes representan el núcleo de un grupo en que los estudios prospectivos identificarán el efecto de la infección por T. rangeli en el curso de la Enfermedad de Chagas.

Introducción

El patógeno humanoTrypanosoma cruzi es el agente causal de la Enfermedad de Chagas a través de Centro y Sur América. Aunque se considera que forma una única especie y produce un patrón relativamente uniforme de infección, existe una notable variación en la presentación de la enfermedad, tanto en su sintomatología como en su severidad.

La evidencia corriente sugiere que la variación interaislado de la expresión de antígenos parasitarios (Plata, Pon s & Eisen, 1984), está relacionada con el zymodeme (Miles, 1983) y su interacción con la respuesta inmune del huésped pueden combinarse para producir una inmunopatogénesis con un resultado variable en la enfermedad (Hudson & Britten, 1985).

Aun más, Segura y sus colaboradores (Ruiz, Estera, Cabeza Meckert, Laguens & Segura, 1985) han mostrado que el conocimiento inmune de diferentes subconjunto de antígenos internos del parásito, en la ausencia de infección, altera el tejido blanco (diana) para la patogénesis, sugiriendo que la respuesta inmune, y la naturaleza de los antígenos reconocidos, no sólo controla el curso de la infección (Scott & Goss-Sampson, 1984) pero también puede determinar los parámetros cualitativos y cuantitativos de la enfermedad.

La corroboración clínica de esta noción viene de los estudios que muestran que mientras la respuesta mitogénica a los antígenos de superficie de T. cruzi no mostraban correlación con el status de la enfermedad, los antígenos internos producían una respuesta mitogénica mayor en pacientes con manifestaciones digestivas, comparados con pacientes asintomáticos (Gusmao, Rassi, Rezende &Neva, 1984).

Hasta ahora, varios estudios detallados han sido realizados para determinar la variedad de polipép tidos de epimastigotes reconocidos por la respuesta inmune de pacientes de diferentes áreas geográficas e infectados con diferentes zymodemes de T. cruzi (por ejemplo, Zingales, Abuin, Romanha, Chiari & Colli, 1984; Nogueira, Unkeless & Cohn, 1982) pero han fallado en identificar cualquier heterogeneidad en el patrón de reactividad inmune. Sin embargo, cuando estudios similares se llevaron a cabo con polipéptidos de tripomastigotes, se observó una variación significativa en el rango de los polipéptidos precipitados (Martins, Hudson, Krettli, Can’rado & Brener, 1985) y fue particularmente informativo en el caso de un paciente del que se disponían muestras seriadas.

En el presente manuscrito reportamos los hallazgos iniciales de un estudio prospectivo iniciado en Norte de Santander, Colombia, en un grupo central de 82 pacientes, 19 de los cuales han sido seguidos hasta por 3.5 años. El análisis de inmunoprecipitación mostró cambios marcados en los polipéptidos precipitados y permitió identificar algunos de los pacientes chagásicos seropositivos como un diagnóstico errado, debido a infección por T. rangeli a una infección con T. cruzi en el curso de este estudio.

Material y Métodos

Muestras de suero fueron obtenidas de dos categorías de pacientes que habitan en un área de alta endemicidad para T. cruzi en los alrededores de Tibú, Norte de Santander, Colombia: (i) habitantes generales de la población, colectados durante una visita que coincidió con los trabajadores de la Campaña Nacional de Vacunación (n = 327) Y(ii) empleados de la Empresa Colombiana de Petróleos (ECOPETROL) (n = 849). Los dos grupos representaban marcadas diferencias en el grado de asistencia médica y condiciones socioeconómicas, pero los dos estaban sometidos a los ciclos de transmisión clásicos de T. cruzi, a través de su contacto con Rhodnius prolixus.

El grupo de ECOPETROL era lo suficientemente estable para facilitar visitas de seguimiento a lo largo de 3.5 años cuando la recolección de suero fue apoyada con el xenodiagnóstico con consentimiento del paciente, y electrocardiograma (ECG) y exámenes clínicos como parte de al asistencia médica proveí da en el hospital de la compañía. El xenodiagnóstico se realizó usando 10 insectos en cada una de 4 cajitas recubiertas de tul. Después de la aplicación en la piel para permitir su alimentación por 30 min, los insectos retornaron al laboratorio y fueron sacrificados a los 30, 60 y 90 días para la detección de T. cruzi por examen microscópico.

Parásitos y Serodiagnóstico

Tripomastigotes de T. cruzi de la cepa Y fueron producidos en cultivos in vitro usando células VERO como fue descrito por Martins et al. (1985) y los epimastigotes para inmunofluorescencia, se hicieron crecer por cultivo monofásico en medio de Warren (Warren, 1960). La cepa San Agustín de T. rangeli fue cultivada en medio RPMI 1640 conteniendo 20% de suero fetal bovino, sin antibióticos, como se describió recientemente (Takle, 1988).

Placas de ensayo con micropozos fueron cubiertas con sonicados de T. cruzi o T. rangeli (50 ullpozo de una concentración de proteína total de 50 ug/m1) o con GP 90 deT. cruzi purificada por afinidad (50 ul/ pozo de 10 ul/ml de proteína) y se usaron para detectar anticuerpos séricos por ELISA, como se describió previamente (Guhl, Hudson, Marinkelle, Jaramillo & Bridge, 1987).

El análisis de inmunofluorescencia fue realizado haciendo reaccionar epimastigotes fijados con formaldehído con diluciones seriadas de las muestras de suelo por 30 min a temperatura ambiente. Después de lavado exhaustivo en solución salina tamponada con fosfatos, el anticuerpo ligado se visualizó con IgG de conejo anti-inmunoglobulina humana conjugada a isotiocianato de fluoresceína usando un microscopio de luz u.v. con epi-iluminación.

Los datos se anotaron como el título más alto que daba una fluorescencia positiva distinguible sobre el fondo definido por sueros controles de individuos no infectados. Los sueros control no mostraron unión a los epimastigotes de ninguno de los parásitos de diluciones mayores o iguales a 1:20.

Análisis de Inmunoprecipitaciòn

Las técnicas para análisis de inmunoprecipitación y electroforesis en geles de poliacrilamida con sodiododecilsulfato (SDS-PAGE) han sido descritos en detalle en otras publicaciones (Wong, Hudson & Hindmarsh, 1986) y se variaron sólo en el uso de geles de acrilamida de 7.5% en paralelo con geles del 10% para algunos sueros, para obtener mejor resolución y estimación del tamaño sobre un peso molecular relativo aparente (Mr) de 100 kDa.

Cuando 1.0 x 10 tripomastigotes marcados extrínseca e intrínsecamente fueron solubilizados en una solución 1% (PN), del detergente no-iónico Renex 30 (Atlas Chemical Company, Leatherhead, R.U.), se encontraron los siguientes cpm asociadas con el material precipitable con Acido Tricloroacético frío: 12513.2± 1.5 x 106 cpm (promedio +/- error standard de 5 determinaciones, en cada caso) y3583.4 +/- 2.1 x 106 cpm. Estas cuentas eran el 69 +/- 3.3% de la incorporación total para el marcaje con 1251y 88 +/ – 7.1% para el marcaje con 35S.

Exámenes Clínicos y Electrocardiogramas (ECG)

Los exámenes y el ECG fueron realizados por el personal médico del Hospital de ECOPETROL en Tibú.

Resultados

La encuesta serológica de los habitantes de la población de Tibú mostró que el 29% de ellos eran positivos para anticuerpos anti -T. cruzi, y más de la mitad del grupo positivo tenía títulos por inmunofluorescencia mayor a 1:80. Aunque la prevalencia de la serología positiva era mucho menor en el personal de ECOPETROL (12%), la distribución de los títulos de inmunofluorescencia era similar a la vista en los habitantes de la población. Las bandas polipépticas mayores de Mr 72- 166 kDa usadas en el análisis se muestran en la Fig. 1.

Bandas polipépticas

El doblete mayor en los 94 kDa (rango 101-80 kDa) consta de dos glicoproteínas principales GP 85 Y GP 90 (8nary, 1985). Generalmente las dos fueron reconocidas con igual intensidad por sueros de pacientes infectados y no se obtuvo resolución en los geles dado el intenso marcaje.

La variación en las distribuciones· de tamaño de polipéptidos precipitados se ilustra en la autorradiografía de dos geles\al10% 8D8-PAGE en la Fig. 2. Análisis previo a la decodificación de las muestras, mostró que la mayoría de los pacientes reconocía los polipéptidos de Mr 150 kDa y un doblete intenso en 95 kDa (rango 101-80 kDa).

Perfil de inmunoprecipitación

Los pacientes individualmente mostraban una variación cuantitativa en las otras bandas analizadas, por ejemplo en el suero el paciente 138 (Fig. 2 carril a: 2) precipitaba un polipéptido de Mr 72 kDa; en tanto que sueros de otros pacientes corridos en el mismo gel no lo hicieron. De manera similar el suero del paciente 165 (Fig. 2, carril b: 7) ‘reaccionó con dos polipéptidos grandes de Mr 137 y 127 kDa y sobre todo, mostró un patrón de bandas más complejo que sueros de otros pacientes en el mismo gel. La frecuencia con que las bandas individuales fueron reconocidas por las muestras de suero se muestran en la Tabla 1.

Frecuencia de sueros polipépticas

Tres pacientes no mostraban patrones de inmunoprecipitación reconocibles: los pacientes 142 y 150 (Fig. 2, carriles a: 6 y a: 7, respectivamente) eran controles negativos, mientras que el paciente 149 (Fig. 2, carrilb: 3) tenía un título anti-T. cruzi por inmunofluorescencia de 1:40. Una búsqueda intensa se condujo en el grupo de pacientes para identificar los seropositivos que no precipitaban los polipéptidos marcados con 125I.

Para asegurar que la ausencia de reactividad no era simplemente un artefacto del método de marcación de superficie, los pacientes también se analizaron contra polipéptidos de tripomastigotes marcados con (358)metionina, como se ilustra en la Figura 3, por ejemplo.

Análisis paralelo en geles del 7.5 y 10% revelaron precisamente el mismo patrón de polipéptidos de alto peso molecular. La mayoría de las muestras de suero de pacientes seropositivos reconocían polipéptidos de 150,94 Y72 kDa. Aunque la resolución de las bandas polipeptídicas de alto peso molecular Mr mayor de 90 kDa fue mejor en el gel de bajo porcentaje, no hubo diferencias cualitativas entre los patrones de bandeo observados.

loading...

DÉJANOS TU COMENTARIO

DEJA UNA RESPUESTA

Por favor ingrese su comentario!