Vacunas de Peste Porcina Clásica producidas en Células, Resultados

Prueba de inocuidad en cerdos

La determinación de los anticuerpos contra PPC el dia cero mostro seronegatividad para todos los animales. De acuerdo con el test de ELISA utilizado, se considera como negativo un suero con menos del 30% de inhibición en la prueba.

En ningun grupo vacunado se observaron reacciones desfavorables locales y/o sistemicas derivadas o atribuibles a la aplicación del producto. Los promedios de temperatura por grupo, se muestran en la figura 1.

Con relacion al registro de la temperatura, teniendo en cuenta las mediciones en la manana y en la tarde, unicamente el dia 4, se observaron diferencias significativas p(>0,05) en los tres tratamientos. Por otro lado, teniendo en cuenta la temperatura diaria, se encontraron diferencias significativas p(>0,05) el dia 3 post vacunación entre el grupo 3 y el grupo de control y el dia 12 post vacunación entre los tres grupos vacunados y el grupo control (figura 1).

Por medio de la prueba de inmunofluorescencia directa se detecto al antigeno tanto en los grupos vacunados como en le grupo control (tabla 1).

Prueba de potencia

En la tabla No. 2, se presentan los resultados de la prueba de potencia para cada una d las vacunas analizadas. Ninguno de los animales de los grupos vacunados presento signos clinicos de PPC durante el periodo de observación postdesafio; por lo tanto el porcentaje de proteccion encontrado fue del 100% para las tres vacunas estudiadas. Sin embargo, cabe anotar que durante el experimento, tres animales (dos del grupo 2 y uno del grupo 3) presentaron signos respiratorios, depresion y fiebre ligera.

Tabla 2
PRUEBA DE POTENCIA DE LAS VACUNAS PROTECCIÓN DE LOS ANIMALES
FRENTE AL DESAFIÓ CON LA CEPA PATOGENA DE PPC

Estos animales fueron sacrificados al final del experimento para investigar la causa de dichos síntomas; en ninguno de ellos se observaron lesiones macroscopicas o microscopicas de PPC; un cerdo presento una pericarditis fibrinosa cronica no especifica, otro presento lesiones microscopicas de deficiencia de vitamina E y selenio. En orto animal no se observaron lesiones histopatologicas. Tampoco se detecto la presencia del virus en la amigdala de estos animales por la tecnica de inmunofluorescencia directa.

Todos los animales del grupo de control presentaron signos clinicos desde el segundo y tercer dia postdesafio, siendo mas evidentes en los cerdos sacrificados los dias 7 y 9. Se observo fiebre alta (mayor o igual 41úC), depresion, incoordinacion, paralisis del tren posterior y postración. A la necropsia se observo lesiones de PPC como eritema y cianosis de la piel, tonsilitis necrotica multifocal, infartos esplenicos marginales, ganglios linfaticos hemorragicos y aumentados e tamano, cerebro congestionado y ulceras en el ileon y en la válvula ileo-cecal y ciego. Esta ultima lesion solo se observo en uno de los animales sacrificados el dia 7 y el sacrificado el dia 9 post-infeccion.

Por histopatologia se confirmo la presentacion de PPC en todos los animales del grupo de control. Igualmente, tanto por IDF como por SERELISA HCV Ag, se detecto el antigeno viral en ls muestras de tonsila de estos animales a partir del tercer dia postdesafio (Tabla No.3).

Tabla 3
PRUEBA DE POTENCIA DE LAS VACUNAS, DETECCIÓN DEL VIRUS DE PPC POR LA INMUNOFLUORESCENCIA
DIRECTA Y ELISA EN LOS ANIMALES DE GRUPO CONTROL, A NIVEL DE LAS TONSILAS.

*IFD : Inmunofluorescencia directa (++: leve +++: moderada; +++: fuerte, muy fuerte ++++
** SERELISA HCV – Ag Rhone Merieux (Positivo : D.O.>0.0961; Negativo: D.O. <0.0961) Con relacion al registro de temperatura corporal, en ninguno de los animales de los grupos experimentales se observo diferencia estadísticamente significativa (p>0.05) entr la temperatura detectada en la manana y en la tarde. Del dia 4 a l dia 9 postdesafio, se presentaron diferencias estadísticamente significativas (p<0.5) entre cada uno de los tratamientos y el grupo control, excepto el dia 8 en el cual solamente el grupo 1 presento diferencias significativas con el grupo de control.

A traves de la prueba de ELISA se confirmo la ausencia de anticuerpos contra el virus de la PPC el dia 0 en todos los animales estudiados.

Por otro lado, el dia 30 post vacunación se detecto que todos los animales de los grupos 1, 2 y 3 desarrollaron respuesta inmunitaria mientras que el grupo control no se detecto anticuerpos (Tabla No.4).

Tabla 4
PRUEBA DE POTENCIA DE LAS VACUNAS DETERMINACIÓN DE ANIMALES CON ANTICUERPOS
A PPC EN LOS DIAS 0 Y 30 POST-VACUNACION POR LA TÉCNICA DE ELISA*.

*ELISA CEDITEST (Institute for animal Science and Health ID-DLO-Holanda):
Positivo, 51-100% de Inhibición; Negativos : 0/30% de Inhibición

De acuerdo cono los resultados presentados en la Tabla 5, en el día 0 del experimento, no se detecto el antígeno viral en ninguno de los animales del grupo control. En el día 7 post-vacunación , en el 100% de las tonsilas de los animales pertenecientes a los grupos 1, 2 y 3 se detecto una fluorescencia fuerte indicando la presencia del antígeno vacunal en este tejido. El día 14 post-vacunación, dos animales de los grupos 1 y 2 presentaron en sus tonsilas fluorescencia moderada y dos fueron negativos, mientras que en el grupo 3, hubo un animal negativo. En el día 21 se detecto una inmunofluorescencia moderada en las tonsilas de los animales de los grupos 1, 2 y3. El día 28 hubo dos animales negativos con las vacunas 2 y3 respectivamente. Mediante la técnica de ELISA empleada, no se detecto el antígeno vacunal en ninguno de los dias post-vacunación evaluados.

Los niveles de anticuerpos a los 0, 7, 14, 21, 28 y 35 días post-vacunación, se reportan en la Tabla No. 6. Desde el día 21 post-vacunación se inicio la detección de anticuerpos e el suero de los animales de los grupos 2 y 3. Sin embargo, en el grupo 1 se comenzaron a detectar dichos anticuerpos desde el día 14 post-vacunación. Mediante un análisis de frecuencias no se encontró diferencias estadísticamente significativas (p>0.5) entre los tres tipos de vacunas con relación a la detección de los anticuerpos en cada uno de los días.

Para que un lote de vacuna se considere satisfactorio a través de la prueba de inocuidad, ningún cerdo vacunado debe presentar reacciones desfavorables atribuibles al producto, y el incremento diario de temperatura durante el periodo de observación no debe ser superior a 0.5úC. En el estudio realizado por el ICA, las vacunas no evaluadas no causaron dignos clínicos locales o sistemicos utilizando 10 veces la dosis indicada. Tampoco se registraron temperaturas febriles en ninguno de los animales vacunados.

En el tercer día post-vacunación, la temperatura promedio del grupo control fue de 39,7úC y la de grupo 3 (39,2úC); aunque esta diferencia de temperatura fue estadísticamente significante no parece estar relacionada con el efecto de la vacuna.

Según Morilla (1994),las cepas del virus no modificado que actualmente se usan en las vacunas de PPC son inocuas para los porcinos; sin embargo pueden causar fiebre y leucopenia en algunos animales. Se sabe también que los cerdos vacunados con la cepa China desarrollan viremia entre los 3 a 11 días post-vacunación, periodo en el cual se puede registrar aumento en la temperatura corporal (Van Bekkum, 1977).

En el presente trabajo, el día 12 post-vacunación se detectaron diferencias significativas de temperatura entre los grupos vacunales 1, 2 y 3 y el grupo de control no vacunado (Figura 1). El mayor promedio de temperatura correspondió al grupo 3 (39,8oC). Es posible que estas diferencias se deban a la viremia causada por la vacuna.

Por otro lado, en la Tabla 1, se aprecia la detección del antígeno vacunal en el grupo control (no vacunado). A este respecto, se ha demostrado que la Cepa China puede ser transmitida de animales vacunados a no vacunados, pero no recobra su patogenecidad (Van Bekkum, 1977). Esto pudo haber sucedido en el experimento ya que todos los animales permanecieron en contacto.

Con relación a la prueba de potencia, la vacuna debe ofrecer mas de un 80% de protección para ser considerada apta (Morilla, 1994). Cuando se han utilizado vacunas para proteger el 80% de los porcinos o menos, se ha observado la presentación clínica de la enfermedad frente a una exposición con un virus de campo y en el caso de los lechones, hijos de cerdas parcialmente inmunizadas, pueden nacer infectados (Luenen et al. 1987).

Terpstra y Wenswoort (1987). Constataron la potencia de 20 lotes de vacunas, encontrando que el 96,7% de los animales respondieron con títulos iguales o mayores de 1:25 de anticuerpos neutralizantes, los cuales fueron protectores al desafío.

En nuestros estudios, las tres vacunas evaluadas mostraron un 100% de protección (tabla 2) y presentaron seroconversion positiva por la prueba de ELISA a los 30 días post-vacunación (tabla 4). Por otro lado, a través de la histopatologia se confirmo la patogenecidad de la cepa utilizada en al descarga y se demostró la presencia de este antígeno en la tonsila de los animales enfermos mediante la IFD y al técnica SERELISA HCV Ag (tabla 3).

En el estudio de la persistencia del virus vacunal en tonsila (tabla 5), el antígeno de los tres biológicos analizados pudo ser detectado por lo menos hasta los 35 días post-vacunación. Sin embargo, se noto una disminución en la intensidad en la fluorescencia observándose en los últimos días focos débiles en algunas células epiteliales de la cripta. Mebus (1980), afirma que estos resultados deben interpretarse cuidadosamente pues una fluorescencia falsa positiva debido a la presencia de eosinofilos en el tejido que emiten una fluorescencia falsa positiva debido a la presencia de sus gránulos. Por lo tanto no se pudo determinar con exactitud en que momento desaparece el antígeno vacunal de las tonsilas ya que el experimento se realizo hasta los 35 días post-vacunación.

Esos hallazgos son muy importantes, pues indica que hasta por lo menos un mes post-vacunación no seria posible diferenciar entre el virus de campo y el virus vacunal de la PPC por medio de esta prueba, siendo necesario en un diagnostico presuntivo de la enfermedad, realizar otro test complementarios y conocer el plan de vacunación para dar un diagnostico positivo.

Los resultados obtenidos en este experimento concuerda con los trabajos realizados por (Terpstra et al. 1978), empleando la cepa China, en los cuales se observo que los animales vacunados fueron positivos por IFD por lo menos dos semanas después de la vacunación.

Por otro lado, en los estudios realizados por Romero (1995), con la vacuna Pestiffa, no se detecto el antígeno vacunal por IDF en amígdala, bazo y riñon en cerdos vacunados siete días antes con 100 días de esta vacuna. Cabe anotar que en estos trabajos se utilizaron dos conjugados policlonales diferentes al conjugado empleado en los experimentos realizados por el ICA.

Con relación a la determinación de anticuerpos contra le virus de la PPC por medio de la técnica ELISA, estos comenzaron a detectarse a partir de los 14 días post-vacunación con la vacuna 1 y a los 21 días con las vacunas 2 y 3. A los 35 días post-vacunación, solo el 50% de los animales se detecto anticuerpos por medio de esta prueba (Tabla 6). El test de ELISA empleado en este experimento tiene un 100% de especificidad ya que no reconoce anticuerpos contra otros pestivirus. Igualmente puede detectar anticuerpos producidos por el virus vacunal o por el virus de campo (Wenswort et al. 1998). En previo trabajo realizado por (Terpstra et al. 1997), se demostró la sensibilidad de este test para demostrar anticuerpos vacunales a los 21 días post-vacunación, lo cual concuerda con los hallazgos obtenidos en le presente estudio.

Tabla 5 DETECCIÓN DEL VIRUS VACUNAL EN AMIGDALA
RESULTADOS DE LAS PRUEBAS DE INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA * Y ELISA *

Tabla 6 PRUEBA DE PRESIDENCIA DEL VIRUS VACUNAL DE PPC A NIVEL DE AMÍGDALA DETERMINACIÓN
DE ANTICUERPOS POSTVACUNACIÓN POR LA TÉCNICA DE ELISA*

* ELISA CEDITEST (DLO-Institute for animal Science and Health ID-DLO-Holanda): Positivos, 51-100% de inhibición; negativos: 0-30% de inhibición
** p/v: No de positivos/NO de vacunados
*** %p: Porcentaje de positividad
DPV: Días postvacunación
NR: No realizado, porque todos los animales control se sacrificaron el día 0.

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