Vacunas de Peste Porcina Clásica producidas en Células

Evaluación de las Vacunas de peste Porcina Clásica producidas en Células y comercializadas en Colombia

M Villamil N., R. Sabogal.
A. Gómez T., Orjuela M, S. Ruíz S.
G. Arbeláez R., M.A. Rincón M.
J.D. Mogollón G.

Contribución de la División de Sanidad Animal y la Divisón de Insumos Pecuarios del Instituto Colombiano Agropecuario ICA, A.A. 29743 Bogotá. Con el aporte económico de la Asociación Colombiana de Porcicultores y Fondo Nacional de la Porcicultura.
Respectivamente: DMV., DMV., Bacterióloga., DMV., MS., PhD., DMV., MS., DMV., MS., PhD.

Resumen

Se realizó un estudio para evaluar tres vacunas contra la Peste Porcina Clásica, producidas en células y comercializadas en Colombia. Se desarrollaron los experimentos con el fin de evaluar la calidad de las vacunas mediante las pruebas de inocuidad y de potencia en cerdos. No se observaron reacciones desfavorables locales o sistémicas atribuibles a la aplicación de los tres productos. Con fines diagnósticos, se determinó la persistencia del virus vacunal en amígdala por lo menos hasta los 35 días post-vacunación.

Abstract

A study was carried out to the classical swine fever vaccines produced in cells culture and marked in Colombia. Experiments under controlled condition were designed to evaluate quality by using Inoquity and potency test in conventional pigs.

In addition, vaccinal virus persistence in tonsils was determined. None side effects or abnormal reactions were detected with any of these vaccines after challenge. The vaccinal antigen was found in the tonsil by direct Inmunofluorescent at least until 35 days post vaccination. The importance of this finding is discussed.

Additional key words : HCV vaccines, protection, viral persistence.

Introducción

La Peste Porcina Clásica (PPC) es una enfermedad vitral descrita inicialmente en Estados Unidos en 1830. Desde entonces, se ha caracterizado por producir altas pérdidas económicas a la porcicultura mundial, debido a su rápida difusión y elevada mortalidad. Además, los animales que logran sobrevivir pueden desarrollar infecciones crónicas a veces imperceptibles y se retrasan para salir al mercado (Gómez et al. 1994).

Debido a los efectos devastadores de esta enfermedad ya al restricción internacional para la comercialización de la carne y productos de origen porcino, muchos países han establecido medidas drásticas para su prevención, control y erradicación de tal forma que algunos países de Europa y América se encuentran libres de PPC.

Por otro lado, países latinoamericanos como México, Chile, Argentina, Uruguay y Brasil han organizado verdaderas campañas de erradicación que han llevado a al declaración de zonas libres o de país libre de PPC. En estas naciones, la ampliación de la cobertura de vacunación y la buena calidad de los productos biológicos utilizados, han sido fundamentales para los éxitos alcanzados.

En Colombia, la prevención y el control de la enfermedad se vienen adelantando a través de la vacunación y la atención de brotes agudos, con lo cual se ha logrado reducir la presentación de la PPC en los últimos años (Gonzalez et al. 1995).

Las vacunas contra PPC que se han empleado son de tipo vivo modificado y de virus inactivado. Las vacunas inactivadas se dejaron de utilizar por ser inmunógenos muy débiles y porque producian foco de infección por virus virulento residual (Aynud et al. 1970). Las vacunas a virus vivo modificado se obtienen por pasajes seriados en conejo (lapinizada) ó por selección de cepas atenuadas e cultivos celulares. Las cepas más utilizadas para la fabricación de vacunas contra PPC han sido : cepa China, cepa GPE, cepa PAV, cepa Thiverval, entre otras (Espuña, 1994). Recientemente salió al mercado una vacuna de subunidad, la cual expresa la glícoproteina gp55 (E1) del virus de la Peste Porcina Clásica (Moorman et al. 1998).

En Colombia, el Isntituto Agropecuario ICA y la Asociación Colombiana de Porcicultores con el apoyo del Fondo Nacional de la Porcicultura, emprendieron a partir de 1997, el Proyecto de Erradiación de PPC en el país. El proyecto contempló como estrategia inicial para la erradicación, la evaluación de tres vacunas contra PPC existentes en el mercado. Para tal efecto, se desarrollaron varios experimentos cuy objetivo fue evaluar la calidad de estos biológicos mediante pruebas de inocuidad y potencia en cerdos. Además, y con fines diagnósticos, se determinó la persistencia del virus vacunal a nivel de las tonsilas en cerdos inmunizados.

Materiales y Métodos

Vacunas

Se utilizaron tres vacunas elaboradas a partir de la Cepa China, tipo virus modificado cosechadas en diferentes líneas celulares. Los tres biológicos se encuentran registrados ante el ICA y se utilizan actualmente para el control de la enfermedad. En el estudio los biológicos fueron identificados como vacuna 1, vacuna 2 y vacuna 3.

Prueba de inocuidad en cerdos

El objetivo de esta prueba, fue verificar la ausencia de efectos indeseables (reacciones locales y/o sistemáticas) en los animales a los cuales se les aplicó cada uno de los biológicos. El procedimiento realizado se basó en lo establecido por el Control Federal Regulation (CFR) de los Estados Unidos para la inocuidad de vacunas en porcinos.

Se utilizaron dos (2) cerdos comerciales por vacuna, dos cerdos como controles negativos (6 cerdos en total), de aproximadamente de 50 días de edad y con un promedio de 17 kilogramos de peso. El día cero (0), cada cerdo fue inoculado por via intramuscular con 10 veces la dosis recomendada por el laboratorio productor. Igualmente, a cada cerdo se le tomó la temperatura corporal y una muestra de sangre sin anticoagulante, con el fi de confirmar la seronegatividad a PPC. Todos los animales permanecieron en contacto con agua y alimento “adlibitum”.

Para la determinación de anticuerpos frente al virus de la PPC se utilizo un kid ELISA comercial CEDITEST (Institute for Animal Science and Health, IDDLO, Holanda). Esta prueba esta basada en dos anticuerpos monoclonales (AcM), que reconocen dos epítopies distintos de la glicoproteinas Gp55 (E2) de la envoltura del virus de la PPC. En la fase sólida hay un AcM que se utiliza para el antígeno; el segundo AcM está conjugado con peroxidasa y el antígeno es un baculovirus al que se le inserto el gen que codifica la proteina E2. Si uno o los dos epítopies son bloqueados con los anticuerpos del suero problema, no habrá reacción indicando que el suero es positivo.

Durante los días 1 a 15 post – vacunación se llevó el registro diario de temperatura a mañana y tarde, así como la observación de cualquier signo clíncio. El día 15 post-vacunación se sacrificaron todos los animales para su respectiva necropsia. De cada uno de los animales, se tomó muestra de amígadala para la detección del antígeno mediante la prueba de Inmunodeficiencia Directa (IFD), (CEDITEST FITC- Institute for Animal Science and Health, ID-DLO, Holanda). Estadísticamente, se hizo un análisis por día, del efecto de los tratamientos y los periodos (mañana y tarde) de la temperatura bajo un diseño completamente al azar.

Prueba de eficacia o potencia

El objetivo de la prueba, fue medir la protección conferida por cada uno de los productos, a los cerdos vacunados y desafiados posteriormente con una cepa patogéna del virus.

Se utilizaron 22 cerdos comerciales clinicamente sanos, seronegativos a PPC, de aproximadamente de 50 días de edad y con un peso promedio de 17.8 kilos. Los animales se distribuyeron e cuatro grupos, así : Grupo 1 (vacuna 1); grupo 2 (vacuna 2) Grupo 3 (vacuna 3), conformado por 5 animales cada uno, y el grupo 4 o grupo control no vacunado formado por 7 animales. Los grupos fueron mantenidos en corrales separados durante el estudio.

El día cero (0), se tomó muestra de sangre sin anticoagulante de todos los animales con le fin de confirmar la ausencia de anticuerpos contra PPC por la técnica ELISA-CEDITEST. Igualmente los cerdos de los grupos 1, 2 y 3 fueron vacunados con cada producto, utilizando una dosis de 2 ml via intramuscular. Los animales permanecieron en observación durante 30 días en unidades de aislamiento con concentrado y agua “ad libitum”.

Terminado este periodo, todos los animales fueron desafiados con una cepa patogena del virus (cepa Santander) recibiendo cada cerdo, un millon de dosis infectante cerdo 50% (106 DIC50%) en 1 ml de inoculo, via intramuscular.

De igual forma, el dia 30 post vacunación se registro la temperatura corporal de cada uno de los animales y se tomo muestra de sangre sin anticoagulante con el fin de determinar los titulos de anticuerpos, a traves del test de ELISA CEDITEST. Durante lo dias 1-10 post desafio, los animales se monitorearon diariamente registrando la temperatura a manana y tarde al igual que los signos clinicos y/o mortalidad.

Para conformar la patogenecidad de la cepa de desafio inoculada, dos animales del grupo de control fueron sacrificados los dias 3, 4 y7 y un animal el dia 9 post desafio. De cada uno de los cerdos se tomo muestra de amigdala palatina con el fin de detectar el antigeno en este tejido, por inmunofluorescencia directa utilizando el conjugado CEDITEST FICT y por el test de SERELISA HCV Ag (Rhone Merieux, Lyon, Francia). Este test es un ELISA indirecto que utiliza cepas monoclonales para la deteccion de la proteina estructural del virus p 125. Ademas, se tomaron muestras de cerebro, tonsila, bazo, ganglio, pulmon e intestinos para el analisis histopatologico.

Estadísticamente se hizo un analisis por dia, del efecto del tratamiento sobre la temperatura en los periodos (manana y tarde) bajo un diseno completamente al azar.

El objetivo de esta prueba fue determinar el tiempo durante el cual se puede detectar el virus vacunal a nivel de amigdala en animales vacunados, por medio de la prueba de inmunofluorescencia directa.

Se utilizaron 66 porcinos comerciales de aproximadamente 50 dias de edad y seronegativos a PPC. Estos se dividieron en tres grupos experimentales 1, vacuna 2, vacuna3, con 4 repeticiones de 5 animales de acuerdo al l peso corporal, para un total de 20 animales por tratmiento. El grupo control se conformo con 6 animales. Los grupos fueron mantenidos en corrales separados durante el experimento..

El dia cero (0) se tomo muestra de sangre sin anticoagulante a todos los animales con el fin de confirmar la seronegatividad a PCC. Ese mismo dia, se realizo la necropsia de los cerdos del grupo control, tomandoles muestra de amigdala a cada uno. Posteriormente, los dias 7, 14 21, 28 y 35 post vacunación, se sacrificaron 4 animales por cada grupoo experimental con el fin de detectar la presencia del virus vacunal a nivel de amigdalas mediante la tecnica de inmunofluorescencia directa utilizando el conjugado CEDITEST FITC y por el test de SERELISA HCV Ag (Rhone Merieux). Estos mismos dias, se tomo muestra de sangre sin anticoagulante para detectar la presencia de anticuerpos contra el virus vacunal de la PPC mediante la tecnica de ELISA CEDITEST. Para la expresión de los resultados obtenidos por la prueba de inmunofluorescencia muy fuerte (++++), fluorescencia fuerte (+++) , fluorescencia moderada (++), fluorescencia leve (+) y fluorescencia negativa (-). Esta clasificacion es cualitativa y se da teniendo en cuenta la intensidad de la fluorescencia observada en la muestra, comparada con la fluorescencia registrada en los tejidos utilizados como control positivo y control negativo. En este estudio se empleo como control positivo un corte de tonsila obtenida de un animal infectado experimentalmente con una cepa de campo y como control negativo las tonsilas de los animales de grupo de control.

Bajo un diseno de bloques completamente al azar se hizo el analisis diario de las temperaturas registradas durante los 35 dias post vacunación para determinar el efecto del tratamiento y/o efecto del periodo (manana y tarde). Ademas se analizaron las frecuencias para la deteccion de anticuerpos con el fin de probar si las mediciones son similares o no en los dos tratamientos.

Tabla No. 1
EXPERIMENTO INOCUIDAD DE LA VACUNA DE PESTE PORCINA CLÁSICA
RESULTADOS DE LA PRUEBA DE INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA.

*CEDITEST FITC: (++) Fluorescencia Moderada
(+++) Fluorescencia Fuerte