Ligamiento Génico y Estudios Mutacionales en 10 Familias Colombianas con Síndrome de Usher

Correlación Genotipo-Fenotipo

Genética al Día

**Silvia Florez, David Medina
***W. J. Kimberling
****Vicente Rodríguez
*****Martha Lucía Tamayo
*Instituto de Genética Humana, Facultad de Medicina, Pontificia Universidad Javeriana, Bogota, D.C.
**Fundación Oftalmológica Nacional-Fundonal, Facultad de Medicina, Universidad del Rosario, Bogotá, D.C.
***Boys Town National Research Hospital, Omaha, NE, USA.
****Dpto de ORL, Hospital San Ignacio, Bogotá.
****Instituto de Genética Humana, Facultad de Medicina, Pontificia Universidad Javeriana, Carrera 7 # 40-62 Edif. 32, Bogota, D.C. – Fundación Oftalmológica
Nacional-Fundonal, Facultad de Medicina, Universidad del Rosario, Bogotá, D.C. – Correo electrónico: mtamayo@javeriana.edu.co

Resumen

Se estudiaron 10 familias colombianas con diagnóstico clínico de Síndrome de Usher del Instituto de Genética de la Universidad Javeriana y de la Fundación Oftalmológica Nacional (FUNDONAL), con el fin de realizar análisis de ligamiento génico y secuenciación de DNA. Estas familias son producto del tamizaje en escuelas para niños sordos y niños ciegos del país. Se evaluaron en total 24 afectados con edades entre los 15 y 61 años. Se realizaron exámenes paraclínicos para confirmar el diagnóstico. Los estudios de ligamiento génico y secuenciación de DNA, arrojaron los siguientes resultados: El 75% de las familias USH1, mostraron en sus pruebas moleculares ligamiento al locus USH1B, se encontraron dos mutaciones: la IVS42-26insTTGAG exón 43 en estado heterocigoto y la R634X (CGA-TGA) exón 16 del gen Myo7A en estado homocigoto. En el 25 % restante, se observó ligamiento a los loci USH1B y USH1C. El 100% de familias tipo II mostraron en sus pruebas moleculares ligamiento al locus USH2A; en el 50% de ellas se encontró la mutación 2299delG en estado homocigoto y en el 16.7% en estado heterocigoto. En el 33.3% restante no se logróidentificar mutación. Se realizó correlación genotipo-fenotipo. En los pacientes USH2A con la mutación 2299delG, se observó un fenotipo retiniano típico y homogéneo.

Todos sus exámenes paraclínicos mostraron anormalidades típicas de la enfermedad y todos presentaron una hipoacusia neurosensorial severa bilateral. En el caso del heterocigoto para la mutación 2299delG, (heterocigoto compuesto, cuya otra mutación no ha sido identificada), la sordera es asimétrica, más profunda que en los otros casos. En los pacientes USH2A sin mutación identificada, el fenotipo retiniano también fue muy homogéneo, con variaciones propias de la progresión de la RP. Actualmente se trabaja en análisis moleculares a un mayor número de niños afectados y sus familias, para realizar una correlación fenotipo-genotipo más amplia.

Abstract

We studied 10 Colombian families with clinical diagnosis of Usher syndrome, from the Human Genetics Institute de at the Javeriana University, and the National Ophthalmologic Foundation (FUNDONAL), with the aim to perform genetic linkage analysis and DNA sequencing. These families were found while searching for Usher Syndrome screening through out the country among schools for the deaf and for the blind. We evaluated 24 affected individuals, which age ranged between 15–61 years. Several exams to confirm the clinical diagnosis were practiced. Genetic linkage analysis and DNA sequencing, showed: The 75% of USH1 families was identified as USH1B, and we confirmed two mutations: heterozygote IVS42-26insTTGAG mutation in exón 43 and homozygous R634X (CGA-TGA) mutation in exón 16 of the Myo7A gene. The other 25% of type 1 families, showed linkage to USH1B and USH1C loci. On the other hand, the 100% of USH2 families was identified as USH2A; 50% of them were homozygous for the 2299delG mutation, and 16.7% was a 2299delG/unknown compound heterozygote. We didn’t find mutation in the other 33.3% of cases. A correlation between clinical and genetic findings was performed. All 2299delG homozygous patients had typical and homogeneous retinal findings and, all of them had severe bilateral sensor neural hearing loss. The 2299delG/unknown compound heterozygote case had asymmetric deafness, profounder than the other cases. The USH2A patients with no identified mutation presented typical retinal findings of progressive RP. We continue working in a major number of affected children and their families, to perform an extensive phenotype-genotype correlation.

Introducción

El síndrome de Usher comprende un grupo de desórdenes de herencia autosómica recesiva, caracterizados por sordera neurosensorial (NS) congénita, Retinitis Pigmentosa progresiva (RP) y disfunción del sistema vestibular en algunos casos. El síndrome es clínica y genéticamente heterogéneo y ha sido dividido en tres tipos. El pediatra debe conocer la clasificación par hacer un diagnóstico adecuado y así, que el genetista haga la asesoría genética correspondiente. El síndrome de Usher tipo I (USH1) se caracteriza por sordera profunda congénita, ausencia de respuesta vestibular y aparición de RP progresiva en la primera o principios de la segunda década de vida. El tipo II (USH2) por sordera congénita de moderada a severa, respuesta vestibular normal, con inicio de RP progresiva en la segunda década de vida. El síndrome de Usher tipo III (USH3) está caracterizado por pérdida auditiva progresiva, respuesta vestibular variable y aparición de RP en edad variable (Tamayo, 1991 y 1993). El síndrome de Usher presenta una significativa heterogeneidad genética: a cada uno de los tres tipos clínicos del síndrome le corresponde uno o más subtipos genéticos; hasta ahora han sido identificados siete loci responsables del fenotipo USH1 (USH1A-G) y cinco de los genes correspondientes, han sido mapeados: USH1B, C, D, F y G (Kimberling, 1992; Smith, 1992; Bork, 2001; Ahmed, 2001; Weil, 2003). El gen correspondiente al fenotipo USH1B (el más común), MYO7A codifica para la proteína Miosina VIIa (Kimberling, 1992). Con respecto al síndrome de Usher tipo 2, se han identificado tres loci: USH2A-C (Kimberling, 1990; Hmani, 1999; Weston, 2004). De estos, el primer gen identificado fue el USH2A (Kimberling, 1990), el cual codifica para la proteína Usherina. Las mutaciones en este gen representan cerca del 50% de las detectadas en todos los tipos de síndrome de Usher. Un solo locus ha sido identificado para el fenotipo correspondiente a USH3, cuyo gen lleva el mismo nombre y está ubicado en la región 3q21q25 y codifica para la proteína Clarín-1 (Adato, 2002).

En el presente trabajo se estudiaron 10 familias colombianas correspondientes a 10 niños propósitos detectados en escuelas para sordos y para ciegos en el país, en quienes se confirmó un diagnóstico clínico de Síndrome de Usher, con el fin de realizar análisis clínicos y moleculares que incluían ligamiento génico y análisis de secuenciación de DNA y lograr así identificar a cual subtipo genético corresponde cada familia e identificación de la mutación causante.

Materiales y Métodos

Población objeto de estudio: las familias fueron seleccionadas durante un tamizaje nacional en institutos de/para niños ciegos y sordos de diferentes ciudades del país, adelantado por el Instituto de Genética Humana de la Universidad Javeriana y la Fundación Oftalmológica Nacional (FUNDONAL). Posterior a la selección se procedió a la firma del consentimiento informado.

Evaluación clínica: se realizó historia clínica completa a cada uno de los niños afectados, se evaluó el mayor número posible de familiares y se elaboró el árbol genealógico de cada familia. Se realizaron exámenes como electrorretinograma (ERG), campimetría, angiografía, fotos de fondo de ojo, audiometría y pruebas vestibulares.

Análisis de Ligamiento Génico: se extrajo DNA para el análisis de ligamiento génico con marcadores altamente polimórficos cercanos a los 11 loci conocidos para el Síndrome de Usher.

SECUENCIACIÒN DE DNA: posterior al análisis de ligamiento génico, se procedió a la secuenciación automática de las muestras que mostraron ligamiento a los loci USH1B y USH2A, a fin de identificar las mutaciones causales. Debido a que estos genes son muy grandes (49 y 20 exones respectivamente), para la secuenciación sólo se seleccionaron aquellos exones en los que la literatura ha reportado presencia del mayor número de mutaciones causales de Síndrome de Usher.

Resultados y Discusión

En total se evaluaron 24 individuos afectados y 65 familiares sanos. El rango de edad de los afectados estuvo entre los 15 y 61 años. Cuatro de las familias (40%) fueron clasificadas como Usher tipo I, con 9 individuos afectados. Las otras 6 familias (60%) se clasificaron como tipo II, con 15 afectados. Nueve familias eran procedentes de Bogotá y una del departamento de Boyacá.

Exámenes Paraclínicos: en la tabla 1 se pueden observar los resultados de los exámenes paraclínicos realizados en los pacientes tipo I y II. Cabe aclarar que no todos los exámenes pudieron ser realizados a la totalidad de los pacientes por diversas razones (dificultad en el entendimiento de la prueba o en el desplazamiento al sitio del examen, entre otras). Se realizaron en total 21 campimertrías, 19 electrorretinogramas (ERG), 16 pruebas vestibulares y 13 angiografías; estas últimas solo fueron realizadas a pacientes con Síndrome de Usher tipo II, por falta de colaboración de los afectados tipo I. Las audiometrías fueron realizadas al 100% de los afectados (Tablas 3 y 4). Los resultados observados confirman el diagnóstico. Acorde con lo reportado en la literatura, las pruebas vestibulares de los pacientes tipo I mostraron disfunción vestibular, mientras las del tipo II mostraron una función vestibular normal (Ahmed, 2001; Joensuu, 2001).

Tabla 1. Resultados de los exámenes paraclínicos realizados a los pacientes tipo I y II.

EXAMEN	RESULTADO		TIPO I	TIPO II
Campimetría	Alteración:		6 (100%)	15 (100%)
	Constricción
ERG	No registrable o Subnormal		8 (100%)	11 (100%)
Pruebas	No actividad		9 (100%)	0
Vestibulares
Angiografía	EPR	Actividad	0	7 (100%)
		Atenuación vasos	–	12
		sanguíneos		(92.3%)
		Alteración del nervio	–	1 (7.7%)
		óptico
		Alteraciones maculares	–	8 (61.5%)
		Atrofia	–	3 (23.1%)
		Espículas de hueso	–	6 (46.2%)
		Moteado	–	4 (30.8%)
		Hipopigmentación	–

Análisis de Ligamiento Génico: en la tabla 2 se presentan los resultados globales de los estudios moleculares. Tres de las 4 familias clasificadas dentro del tipo I (75%) mostraron ligamiento al locus USH1B, y en la familia restante (25%) se observó ligamiento a los loci USH1B y USH1C. Con respecto a las familias clasificadas dentro del tipo II, todas mostraron en sus pruebas moleculares ligamiento al locus USH2A, concordante con lo reportado en la literatura mundial. Los resultados de las pruebas moleculares confirmaron que la caracterización de tipos que se había hecho previamente, a partir de las manifestaciones clínicas, fue acertada.

Tabla 2. Resultados obtenidos a partir de los análisis de ligamiento génico y secuenciación automática.

Tipo clínico	familia	Ligamiento	Lod score	Mutación
Tipo I	4USH	USH1B	Zmax = 2,79	No identificada
		USH1C	Zmax = 3,25
	5USH	USH1B	Zmax = 3,31	Heterocigoto para IVS42-26insTTGAG Myo7A
	10USH	USH1B	Zmax = 3,78	R634X (CGA-TGA) exón 16 del gen Myo7A
	29USH	USH1B	Zmax = 4,04	No identificada
Tipo II	2USH	USH2A	Zmax = 1,33	2299delG del gen Usherina
	19USH	USH2A	Zmax = 3,75	No identificada
	26USH	USH2A	Zmax = 3,59	No identificada
	28USH	USH2A	Zmax = 3,44	Heterocigoto para 2299delG gen Usherina
	32USH	USH2A	Zmax = 3,06	2299delG del gen Usherina
	34USH	USH2A	Zmax = 3,02	2299delG del gen Usherina

Análisis de Secuenciación Automática:

la secuenciación arrojó los siguientes resultados: De 10 familias en las que encontramos ligamiento positivo, se detectó mutación en 6 (60%). Con respecto a las familias tipo I que mostraron ligamiento al locus USH1B, se encontraron dos mutaciones: la IVS42-26insTTGAG en estado heterocigoto y la R634X (CGA-TGA) exón 16 del gen Myo7A en estado homocigoto. En las familias USH tipo II con ligamiento al locus USH2A, se identificó en 3 de ellas la mutación 2299delG en estado homocigoto (50%), y una en estado heterocigoto (16,7%). En otras dos familias no se logró identificar mutación (33,3%).

El análisis de las 6 familias tipo II mostró una alta frecuencia de la mutación 2299delG en el gen de la Usherina (66,7%), que define a estas 4 familias como subtipo 2A; esta mutación es reconocida en la literatura como la más frecuente en el Síndrome de Usher tipo II (aproximadamente del 16%) (Beneyto, 2000; Eudy, 1998; Bernal, 2003).

Correlación fenotipo-genotipo: se compararon los hallazgos de los niños propósitos y familiares afectados en el examen de fondo de ojo y demás exámenes paraclínicos, teniendo en cuenta sus resultados moleculares. En la tabla 3 se presentan los hallazgos fenotípicos de los pacientes USH tipo 1B. Las alteraciones del nervio óptico incluyen palidez y drusas; las alteraciones maculares incluyen edema, presencia de membrana epiretiniana y alteraciones pigmentarias. En la tabla 4 se presentan los hallazgos de los pacientes USH2A. Comparando los hallazgos fenotípicos de todos los pacientes afectados que participaron en el estudio, se pudo constatar que a medida que avanza la edad, la enfermedad también se muestra másavanzada, concordante con una típica patología progresiva; no observamos casos de mayor severidad clínica a menor edad. Además de los hallazgos típicos de la RP, como son las espículas de hueso en periferia media, la palidez del nervio óptico y la atenuación de vasos sanguíneos, se puede observar que son bastante frecuentes las alteraciones en vítreo en ambos tipos del Síndrome de Usher.

Tabla 3. Hallazgos en el fondo de ojo de los pacientes cuyas pruebas moleculares mostraron ligamiento a USH1B.

HALLAZGOS			Heterocigotos para IvS42- 26insTTGAG(n=3)	Homocigotos compuestos R634X (CGA-TGA) / Desconocido(n=3)	Sin mutación identificada(n=2)	Ligamiento a uSH1B y uSH1C(n=1)
Oculares	Atenuación vasos sanguíneos		3 (100%)	3 (100%)	2 (100%)	1 (100%)
	Alteración nervio óptico		3 (100%)	3 (100%)	0	1 (100%)
	Alteraciones maculares		3 (100%)	3 (100%)	2 (100%)	0
	EPR	Atrofia	0	3 (100%)	0	1 (100%)
		Espículas de hueso	1 (33.3%)	3 (100%)	2 (100%)	1 (100%)
		Moteado	0	0	2 (100%)	1 (100%)
		Hipopigmentación	3 (100%)	3 (100%)	0	0
	Alteraciones en vítreo		2 (66.7%)	3 (100%)	0	1 (100%)
	Catarata		0	3 (100%)	0	1 (100%)
Audiológicos	HNS moderada		0	0	0	0
	HNS moderada – severa		0	0	0	0
	HNS severa		0	0	0	0
	HNS severa – profunda		0	0	2 (100%)	0
	HNS profunda bilateral		3 (100%)	3 (100%)	0	1 (100%)
	HNS asimétrica		0	0	0	0

 

Tabla 4. Hallazgos en el fondo de ojo de los pacientes cuyas pruebas moleculares mostraron ligamiento a USH2A.

HALLAZGOS			Homocigotos para 2299delG(n=6)	Heterocigoto compuesto 2299delG / Desconocido(n=1)	Sin mutación identificada(n=8)
Oculares	Atenuación vasos sanguíneos		5 (83.3%)	1 (100%)	8 (100%)
	Alteración nervio óptico		2 (33.3%)	0	6 (75,0%)
	Alteraciones maculares		2 (33.3%)	0	3 (37,5%)
		Atrofia	0	0	3 (37,5%)
		Espículas de hueso	5 (83.3%)	1 (100%)	6 (75,0%)
		Moteado	2 (33.3%)	1 (100%)	1 (12,5%)
		Hipopigmentación	4 (66.7%)	0	1 (12,5%)
	Alteraciones en vítreo		3 (50.0%)	1 (100%)	5 (62,5%)
	Catarata		3 (50.0%)0	1 (100%)	5 (62,5%)
Audiológicos	HNS severa – profunda		0	0	2 (25,0%)
	HNS moderada – severa		1 (16.7%)	0	2 (25,0%)
	HNS severa		4 (66.7%)	0	3 (37,5%)
	HNS severa – profunda		0	0	0
	HNS profunda bilateral		0	0	0
	HNS asimétrica		1 (16.7%)	1 (100%)	1 (12,5%)

Como se puede observar en las tablas 3 y 4, el fenotipo ocular y auditivo del Usher tipo I parece ser más severo que el del tipo II. La frecuencia de la palidez del nervio óptico es mayor en el tipo I, así como también la presencia de alteraciones maculares. La hipopigmentación del EPR parece ser una característica común para los fenotipos correspondientes a las dos mutaciones identificadas en las familias tipo I (IVS42-26insTTGAG y R634X). Adicionalmente, los 2 pacientes tipo USH1B en quienes no se detectó mutación, manifiestan un fenotipo auditivo menos severo, probablemente debido a una mutación menos agresiva.

Con respecto al paciente con pruebas moleculares que mostraron ligamiento a los loci USH1B y 1C (probablemente porque ambos están en el mismo cromosoma) queda pendiente definir a cual de los dos loci corresponde realmente. La estrategia para definirlo a futuro, sería utilizar marcadores más específicos de cada región.

Debido a que no hay dos familias tipo I con la misma mutación, no hay modo de establecer comparaciones según el tipo de mutación, dado que las dos únicas mutaciones identificadas en este grupo sólo se repiten de forma intrafamiliar y el fenotipo suele ser muy similar entre ellos.

Para este punto, es preciso esperar a detectar un mayor número de familias con la misma mutación identificada en este caso.

A partir de nuestros análisis pudimos constatar que el fenotipo es muy homogéneo para todos los pacientes clasificados dentro del tipo II, quienes en sus pruebas moleculares mostraron un estado homocigoto de la mutación 2299delG. En el caso que presenta heterocigocidad para la mutación 2299delG del gen Usherina, se puede inferir que debe tratarse de un heterocigoto compuesto, cuya otra mutación no ha sido identificada aún. Es posible pensar que la otra mutación contribuya de manera importante en la producción de un fenotipo más severo, ya que el paciente presenta una hipoacusia asimétrica severa en oído izquierdo y profunda en oído derecho. Observamos atrofia del EPR en 3 pacientes con ligamiento a USH2A pero sin mutación identificada; comparando con los casos que presentan la mutación 2299delG de forma homocigota o heterocigota en donde no se observa este patrón, es posible pensar que la mutación 2299delG no sea responsable de un fenotipo tan agresivo como las que pudieran estar presentes en las otras familias. Se observa también la presencia de hipoacusia asimétrica en cada uno de los grupos, lo que nos lleva a pensar que, al menos en este caso, este fenómeno no está asociado con un tipo de mutación específica.

Actualmente, se está trabajando en realizar los análisis de ligamiento y de secuenciación en un número mayor de familias, con el fin de tener una mayor cantidad de datos, para así poder realizar una correlación fenotipo-genotipo más amplia. Por esta razón, en las perspectivas futuras, está la ampliación del programa de tamizaje y la detección de un mayor número de familias afectadas.

Agradecimientos

Esta investigación fue financiada por COLCIENCIAS con el proyecto-Código No. 1203-04-11732, Contrato No. 141- 002 y por el Instituto de Genética Humana de la Universidad Javeriana en Bogotá. Proyecto No 1045 titulado “Ligamiento génico y estudios mutacionales en 10 familias colombianas con Síndrome de Usher”. Agradecemos al Hospital Universitario San Ignacio por los exámenes audiométricos; a la Fundación Oftalmológica Nacional y a la Clínica Horus por los exámenes oftalmológicos. Al Boys Town National Research Hospital en Omaha, NE, USA. Un especial reconocimiento a los pacientes y sus familias, que gentilmente aceptaron participar en este estudio, así como a todos los institutos de y para niños ciegos y sordos del país.

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