Frecuencia de Aparición de Estafilococos Resistentes a Meticilina, Material y Métodos

Microorganismos ensayados: 425 cepas de Staphylococcus sp, aislados de infecciones intrahospitalarias. Las cepas fueron obtenidas de los hospitales que se relacionan a continuación.

La conservación de las cepas se llevó a cabo por el método de crioconservación a -70 °C, en medio Müeller-Hinton con 30% de glicerol y suplementado con oxacilina (si la cepa era meticilina resistente).

Las cepas Staphylococcus aureus 1870, sensibles a meticilina y Staphylococcus aureus 1426 resistentes, donadas por el Dr. Eddie Power del St Thomas Hospital, en Londres, fueron utilizadas como control negativo y positivo en los ensayos.

Para el control de la calidad se utilizaron las cepas Staphylococcus aureus ATCC 25923 según lo recomendado en las guías NCCLS (enero del 2000) (13).

Clasificación de las cepas

Todas las cepas fueron clasificadas utilizando el ensayo de Rapi-Staph y la prueba de la Staphylasa de Biomérieux, así como los criterios morfológicos de crecimiento en placas de agar sangre de carnero al 5% y en medio Staphylo 110 (Merck).

Ensayo de susceptibilidad

Se utilizó el método de difusión en disco para la determinación de la susceptibilidad a los siguientes antibióticos: penicilina G (P), oxacilina (OX), amoxicilina (AMX), ciprofloxacina (CIP), eritromicina (E), clindamicina (DA), gentamicina (CN), tetraciclina (TE), sulfametoxazol/trimetoprim (SXT), cloranfenicol (C) y vancomicina (VA) (Unipath-Oxoid, UK), según NCCLS (13).

Ensayo de crecimiento en placas de oxacilina Las cepas de estafilococos fueron sembradas en medio Müeller-Hinton agarizado que contenía oxacilina (Smith-Kline Beecham Pharmaceuticals, UK) a 6 g/ml más 4% NaCL e incubados a 35 °C por 24 horas, según lo recomendado en las guías NCCLS. Las cepas capaces de crecer en este medio fueron clasificadas como meticilinaresistentes (MRS) (13).

Determinación de la concentración mínima inhibitoria (MIC)

A cada cepa MRS se le determinó la con-centración mínima inhibitoria por el método de microdilución en caldo, según NCCLS (29), con una concentración inicial de células de aproximadamente 5×105 ufc/ml.

Los antibióticos utilizados fueron: oxacilina (Smith-Kline Beecham Pharmaceuticals, UK), penicilina (Sigma) y vancomicina (Sigma) a concentraciones entre 0,25 y 256 g/ml.

Detección de beta-lactamasas

La presencia de la enzima ß-lactamasa fue realizada por el método de nitrocefin (Oxoid, UK) de acuerdo con las indicaciones del fabricante para todos los aislamientos (2).

Detección de la presencia del gen mecA

Para la detección de la presencia del gen mecA, el cual codifica para las enzimas PBP 2a que funcionan como transpeptidasas del péptidoglicano y poseen afinidad por los antibióticos ß-lactámicos, se utilizó la metodología descrita por Steven M. Salisbury y col, de reacción múltiple en cadena de la polimerasa utilizando los “primer” descritos por Predari y col. para la detección del gen mecA y los primer universales modificados por Relman y col para la identificación del RNA 16S ribosomal.

Los reactivos utilizados para la reacción fueron obtenidos de Amershan, Inglaterra.

En la Figura 1, se muestra el flujograma para la identificación de las cepas meticilinaresistentes.

Figura 1. Esquema general de trabajo.
R: resistente, S: Sensible, O: oxacilina, P: peniclina, MIC: concentración mínima inhibitoria,
MLS: macrólido, lincosamidas, estreptogramina.

El procesamiento de los datos se llevó a cabo mediante un programa diseñado en Borland Delphin que trabaja con una base de datos en Access, la cual es interrogada utilizando las SQL. El programa fue diseñado en los laboratorios DIRAMIC, Cuba