Actividad In Vitro de la Azitromicina, Métodos

a) Cepas

Se incluyeron las cepas de Shigella spp. aisladas consecutivamente de niños con enteritis mucosanguinolenta con edad entre 4 meses y 14 años que acudieron a los centros IPS (Asunción, Paraguay) o al Sanatorio San Lucas, así como muestras de pacientes referidos al LACCIM, hasta alcanzar la cifra de 100 aislados.

b) Aislamiento e identificación de las cepas

Las heces fueron obtenidas en forma espontánea en el momento de la admisión del paciente o bien recolectadas por hisopado anal efectuado por un pediatra o una enfermera entrenada. Siempre que fue posible, las heces fueron cultivadas dentro de la hora posterior a su obtención, ya que con ello logramos mayor recuperación; de lo contrario, fueron inoculadas en el medio de transporte Cary Blair por no más de 12 horas

Cuando se sospechó sepsis o bacteremia se tomaron dos muestras de sangre para hemocultivo. Las muestras de heces fueron observadas microscópicamente para enumerar la cantidad de hematíes y leucocitos, y se cultivaron en medio XLD o SS media (Difco USA, Paraguay o Biokar-France, Argentina) y además se enriquecieron en caldo selenito que se incubó por 24 horas y luego se inoculó en los medios sólidos citados.

La identificación de Shigella spp se realizó por metodol ogí a estandarizada artesanal y se confirmó a nivel de especies por métodos serológicos det (Difco-USA en Paraguay o Pasteur – Mérieux – Francia en Argentina).

c) Pruebas de sensibilidad a los antibacterianos

Las puebas de sensibilidad iniciales se realizaron por el método de difusión en agar empleando en Paraguay discos de papel (Difco – USA) y en Argentina tabletas Neosensitabs (Rosco – Denmark), para los siguientes anti-bacterianos: ampicilina (AM); trimetoprima – sulfametoxazol (TS); cefixima (FX); ceftriaxona (CX); furazolidone (FZ) (nitrofurantoín en Paraguay); gentamicina (GE); ciprofloxacina (CI); ácido nalidíxico (NA) y, únicamente en Argentina, fosfomicina (FO).

Todas las cepas, tanto las originarias de Paraguay como las de Argentina fueron ensayadas en CEA para determinar la concentración inhibitoria mínima (CI M) de la fosfomicina por el método de macrodilución en agar con la inclusión de 50 mg/L de glucosa 6-fosfato en el medio.

A todas las cepas resistentes a FX, CX, GE, CI o NA por difusión, les fue determinada la CIM por el método epsilométrico (E-test. AB Biodisk -Suecia). El mismo método se utilizó para determinar la CIM de la AZ. La determinación de la CIM de la AZ se efectuó tanto a p H 7.2 como a pH 8.0 (colónico).

Resultados

Distribución de la Shigella spp en relación al país de origen y a las especies identificadas. Fueron aisladas un total de 100 cepas de Shigella, de las cuales 72 fueron identificadas como pertenecientes al género flexneri y 28 al género sonnei (Tabla 1). De las 100 cepas, 70 fueron aisladas en Paraguay y 30 en Argentina (Tabla 1).

Tabla 1.
Distribución de Shigella spp en relación
al país de origen y a las especies identificadas.

Número y porcentaje de cepas sensibles determinadas por difusión en agar. Las 72 cepas de Shigella flexneri fueron altamente sensibles a FX, CX, GE, NA, CI y FO, y con altas tasas de resistencia para AM y TS. Las 28 cepas de Shigella sonnei presentaron tasas el evadas de sensibilidad frente a todos los antimicrobianos ensayados, con excepción de TS (Tabla 2).

Tabla 2.
Número y porcentaje de cepas sensibles determinadas
por difusión en agar.

Resultados de la CIM para las cepas resistentes por difusión en agar. Las cepas resistentes a FX, Cx y GE correspondieron a cepas de S. flexneri productoras de betalactamasas de espectro extendido CTX-M-2 junto con la betalactamasa de espectro ampliado TEM-1 (G. Gootkind y M. Quinteros). Demostramos que ambas cepas fueron capaces de transferir la resistencia a una cepa aceptora E.coli J53. Las dos cepas de S. flexneri resistentes a CI fueron también resistentes a NA. Las otras 2 cepas resistentes al NA presentaron una CIM de 1mg/L para la CI. Todas las cepas resultaron sensibles a FO con CIM = 64 mg/L (Tabla 3).

Tabla 3.
Resultados de la concentración inhibitoria mínima
(CIM) para las cepas resistentes por difusión en agar.

 
Resultados de las CIM de la azitromicina a diferentes pH. Las cepas de Shigella flexneri presentaron una CIM 50 y CIM 90 de 4 y 6 mg/L a pH 7,2 y de 1,5 y 3 mg/L a pH 8,2.

Las CIM 50 y CIM 90 observadas en las cepas de Shigella sonnei fueron respectivamente 4 y 6 mg/L a pH 7,2 y 1,5 y 3 mg/L a pH 8,2. El 100% de las cepas estudiadas fue sensible a la azitromicina.

Correlación entre los valores de CIM y los resultados de difusión para la azitromicina. Todas las cepas, excepto una de S. flexneri que mostró CIM de 32 mg/l (halo de 11 mm), mostraron halos = 12 mm. Por lo tanto, proponemos este punto de corte provisional para discos o tabletas comerciales de 5 µg de AZ. Estamos realizando estudios con discos de mayor carga para facilitar la discriminación de la sensibilidad de enteropatógenos a la AZ.

Discusión

La S. flexneri demostró ser la especie prevalente de Shigella spp tanto en Asunción, Paraguay como en Buenos Aires, Argentina. En segundo término se aisló la S. sonnei. Durante el período de realización de este estudio no se aisló ninguna cepa de S. boydii ni S. dysenteriae.

Las cepas de S. flexneri mostraron mayor resistencia que las de S. sonnei.

Solamente la AZ y la FO mostraron 100% de sensibilidad en nuestros aislados.

Durante este estudio aislamos dos cepas de S. flexneri productoras de betalactamasa de espectro extendido y por lo tanto resistentes a los betalactámicos ensayados.

Aislamos tres cepas de Shigella resistentes a la CI. La resistencia al NA resultó un buen marcador para sospechar la resistencia a la CI.

La AZ surge como una alternativa promisoria para el tratamiento de la shigelosis considerando la alta sensibilidad a concentraciones fácilmente alcanzables en heces (70), su actividad intracelular, la posibilidad de administrarla en una dosis diaria y su perfil de seguridad. Teniendo en cuenta su larga vida media, hemos iniciado ensayos para determinar la posible efectividad del tratamiento con una única dosis total.

Finalmente, debe tomarse en cuenta que los puntos de corte para la sensibilidad a la AZ no están considerados por NCCLS para bacilos gramnegativos y por otra parte, tampoco se tiene en cuenta su mayor actividad en el pH alcalino que se encuentra en el colon.

Summary

Shigellosis has a very high incidence as acause of enteritis and hospitalization in South American countries. We determinated the in vitro activity of different antimicrobials commonly used for the treatment of paediatric invasive enteritis against 100 consecutive strains of Shigella spp. isolated from children from Asuncion (70) and the Buenos Aires Province (30). All the isolates were obtained from stools presenting leukocytes, red blood cells and/or mucus. S. flexneri accounted for 72% of the isolates and S. sonnei for 28%. No other species of the genera was recovered. Three cases of S. flexneri enteritis ocurred with simultaneous bacteriemia. Two S. flexneri producers of CTX-M-2 ESBLs were detected. Susceptibility to Ampicillin (AM); Trimethroprim-sulfa (TS); Cefixime (FX); Ceftriaxone (CX); Furazolidone (FZ); Gentamicin (GE); Ci profloxacin (CP); Nalidixic acid (NA) and Fosfomycin (FO) were determinated by diffusion with Neosensitab tablets using regression results according to NCCLS M-100-S 9 when available. MICs for azithromycin (AZ) were determined by the E test method in agar Mueller Hinton at pH 7,2 and also at pH 8.2 since lower MIC values for AZ at the formal colonic pH have been observed for enterobacteria (Casella JM et al ICMASK Barcel ona 1998). No important differences in resistance traits were observed among our isolates except for AM (resistance for S. flexneri 65% and for S. sonnei 10%). The susceptibility percentages for diffusion tests were:

.
Resistance to FX and CX was obser ved among ESBLs producers (MICs>32 mg/l) and the 3 IP resistant strains showed MICs of 4-4 and 16 mg/l. Results of MICs observed against AZ were at pH 7,2: MIC range 0.5-32 mg/l. MIC 90: 6 mg/l. At pH 8,2, MIC range 0,12-4 mg/l. MIC 90: 3 mg/l. This MIC are quite below the levels of AZ expected to be found in the colonic content at normal dosages. In conclusion, clinical trials using AZ for shigellosis treatment should be encouraged considering AZ activity, intracellular and tissue high concentrations, safety and the possibility of short course treatments.

Referencias

1. Hines J, Nachamkin I. Effective use of the Clinical Microbiology Laboratory for diagnosing diarrheal diseases. Clin Infect Dis 1996; 23: 1292-1301.
2. Salam M, Bennish M. Therapy for Shigellosis I. Randomised double-blind trial of nalidixicacid in childhood shigellosis. J Pediatr 1988; 113: 901-907.
3. Ashkenazi S, Green M, Gdalevich M, et al. Bouble. blind vaccine-controlled randomised efficacy trial of an investigational Shigella sonnei conjugate vaccine in young adults. Lancet 1997: 349: 155-159.
4. Cash R. Inappropiate treatment for disentery (letter). BMJ 1996; 313: 181-183.
5. Benni sh L, Sal am MA, Hossai n MA, et al. Antimicrobial resistance of Shigella isolates in Bang- ladesh, 1983-1990: Increasing frecuency of strains multiply resistant to ampicillin, trimethoprim-sulfame-thoxazole, and nalidixic acid. Clin Infect Dis 1992; 14: 1055-1060.
6. Keush GT, Bennish ML. Shigellosis: recent progress, persisting problems and research issues. Pediatr Infect Dis 1989; 8: 713-719.
7. Casellas JM, Laspina F, Baez E. Evolución de la resistencia antibiótica en Shigella durante el período 1992-1997: análisis de 410 cepas. En: Primer Congreso Paraguayo de Infectología. Asunción, noviembre de 1997. Resumen N ° 7.
8. MoreiraV, Basualdo W, Campos A, Arbo A. Perfil de resistencia antimicrobiana de Shigella. En: Primer Congreso Paraguayo de Infectología. Asunción, noviembre de 1997. Resumen N ° 2.
9. Keush GT, Bennish ML. Shigellosis. In: Evans AS, Brachman P, eds. Bacterial diseases of humans. 2nd de. New York: Plenum; 1989.
10. Buttler T, I slam MR. Bar dhan PK. The l eu- kemoid reaction in shigellosis. Am J Dis Child 1984; 138: 162-165.
11. Molla A, Molla AM, Sarker Sa, Khatoon M, Rahanan MM. Effects of diarrhea on absorption of macronutrients duringacute and afterst age recovery. In: Chen LC, Scrimmshaw NS, eds. Interactions of diarrhea and malnutrition. Pathophysiology, epidemiology, and interventions. New York: Raven Press; 1983: 143-154.
12. Goren A, Freier S, Passwell JH. Lethal Toxic Encephal opathy due to childhood shigellosis in a developed country. Pediatr 1992; 89: 1189-1193.
13. Perles Z, Bar-Ziv J, Granot E. Brain edema: an underdi agnosed complication of shigella infection (letter). Pediatr Infect Dis 1995; 14: 1114-1115.
14. Hal e TL, Formal SB. Pat hogenesis of shigella infections. Pathol Inmunol Res 1987; 6: 117-127.
15. Sansonetti PJ. Genetic and molecular basis of epitelial cell invasion by Shigella spp. Rev Infect Dis 1990; 123: 1234-1232.
16. Fasano A. Cellular Microbiology: How enteric pathogens socialize with their intestinal host. ASM News 1997; 63: 259-265.
17. Ashkenasi S, Cleary K, Pickering L, Murray B, Cleary T. The association of Shiga toxin and other cytotoxins with the neurologic manifestations of shigellosis. J Infect Dis 1990; 161: 961-965.
18. Ashkenasi S, Cleary T. Antibiotic treatment of bacterial gastroenteritis. Pediatr Infect Dis J 1991; 10: 140-148.
19. Haltalin KC, Nelson JD, Kusmiesz HT, et al. Optimal dosage of ampicillin in shigellosis. J Pediatr 1969; 74: 626-631.
20. Nelson JD, Haltalin KC. Comparative efficacy of cephalexin and ampicillin for shigellosis and other types of acute diarrhea in infants and children. Antimicrob Agents Chemother 1975 ;7: 415-420.
21. Ostrower VG. Comparison of cefaclor and ampicillin in the treatment of shigellosis. Postgrad Med J 1979; 55: 82-85.
22. Salam M, Bennish M. Antimicrobial therapy for shigellosis. Rev Infect Dis 1991; 13 (Suppl 4): S332-S341.
23. Salzman TC, Scher CD, Moss R. Shigellae with transferable drug resistance outbreak in a nursery for premature infants. J Pediatr 1967; 71: 21-26.
24. Arvidson A, Alvan G, Angelin B, Borga O, Nord CE.Ceftriaxone: Renal and biliary excretion and effect on the colon microflora. J Antimicrob Chemother 1982; 10: 207-215.
25. Quintiliani R, Nightingale CH, Freeman CD. Pharmacokinetic and pharmacodinamic considerations in antibiotic selection, with particular attention to oral cephalosporins. Infect Dis Clin Pract 1994; 3: 1-7.
26. Stofer DJ. Treatment of bacillary dysentery: with special reference to stosstherapy with tetracicline. Br Med J 1962; 1: 1179-1181.
27. Haltalin KC, Nelson JD, Hinton LD, Kumiesz M, Sladoje M. Comparison or orally absorbable and nonabsorbable antibiotics in shigellosis. A double- blind study with ampicillin and neomicin. J Pediatr 1968; 72: 708-720.
28. Lexomboom U, Mansuwan P, Duangmani C, Benajapol P, Mc Minn MT. Clinical evaluation of co-trimoxazole and furazolidone. Br Med J 1972; 1: 23-26.
29. Nelson JD, Haltalin KC. In-vitro susceptibil ity of E. coli, Shigellae and Salmonellae to kanamicin and therapeutic implicactions. Ann NY Acad Sci 1966; 132: 1006-1012.
30. Haltalin KC, Nelson JD. Failure of furazolidone therapy in shigellosis. Am J Dis Child 1972; 123: 40-44.
31. Haltalin KC, Nelson JD, Kusmiesz HT, Hinton LV. Comparison of intramuscular and ampicillin therapy for shigellosis. J Pediatr 1968; 73: 617-622.
32. Orenstein WA, Ross L, Overturf GD, Wilkins J, Redfield DR, Underman A. Antibiotic treatment of acute shigellosis: failure of cefamandole compared with trimethoprim – sulfamethoxazole and ampicillin. Am J Med Sci 1981; 282: 27-33.
33. Nelson JD, Haltalin KC. Oral orint avenous trimethoprim-sulfamethoxazole therapy for shigellosis. Rev Infect Dis 1982; 4: 546-550.
34. Hoffman J A, Kim KS .Failure of cefotaxime therapy in a child with shigellosis. Pediatr Infect Dis J 1996; 15: 175-176.
35. Zorzi V, Rolón JJ, Rojas N, Casellas JM. Falla de la cefotaxima en el tratamiento de shigellosis en un paciente pediátrico. En: V Congreso Paraguayo de Pediatría. Asunción, octubre de 1996. Resumen No.137.
36. Bennish M, Salam MA, Khan WA, and Khan AM. Treatment of Shigellosis III. Comparison of one or two-dose ciprofloxacin with standard 5-day therapy. Ann Intern Med 1992; 117: 727-734.
37. Butler T, Lolheka S, Rasidi C, et al. Treatmet of acute diarrhea: a multicenter international trial comparing placebo with fleroxacin given as a single dose or once daily for 3 days. Am J Med 1993; 4: S187-S194.
38. Dupont HL, Ericcson CD, Mathewson JJ, Dupont MW. Five versus three days of ofloxacin therapy for traveler diarrhea: a placebo-controlled study. Antimicrob Agents Chemother 1992; 36: 87-91.
39. Gendrel D, Moreno JL, Nduwimana M, Baribwira C, Raymond J. One-dose treatment with pefloxacin for infection due to multidrug-resistant Shigella dysenteriae Type 1 in Burundi. Clin Infect Dis 1997; 24: 83.
40. Gotuzzo E, Oberhelman RA, Maguña C, et al. Comparison of single-dose treatment with norfloxacin and st andard 5-day treatment with trimethoprim-sulfamethoxazole for acute shigellosis in adults. Antimicrob Agents Chemother 1989; 33: 1101-1104.
41. Elditz-Marcus T, Cohen YH, Nussinovitch M, Ellan I, Varsano I. Comparative efficacy of two-and five-day courses of ceftriaxone for treatment of severe shigellosis in children. J Pediatr 1993; 123: 822-824.
42. Sac k RB, Rahman M, Yunus M, Khan EH. Antimicrobial resistance in organisms causing dairrheal disease. Clin Infect Dis 1997 ;24 (suppl): S 102-105.
43. Heikkila E, Siitonen A, Jahkola M, et al. Increase of trimethoprim resistance among Shigella species 1975-1988: analysis of resistance mechanisms. J Infect Dis 1990; 161: 72-74.
44. Buchbinder M, WebbJC, Anderson LV, Mc Cabe WR. Laboratory studies and clinical pharmacology of nalidixic acid (WIN 18, 320) Antimicrob Agents Chemother 1962; 308-317.
45. Casellas JM (Sr), Guzmán Blanco M, Pinto ME. The Sleeping Giant. Antimicrobial Resistance. Infect Dis Clin North Am 1994; 8: 29-45.
46. Guzmán Blanco M, Casellas JM (Sr), Sader H. Bacterial Resistance to Antimicrobial Agents in Latin America: The Giant is awakening. Infect Dis Clin North Am 2000; 14: 67-81.
47. Ronald Ar, Turk M, Petersdorf RG. A critical evaluation of nalidixic acid in urinary tract infections. N Engl J Med 1966; 275: 1081-1089.
48. Sanders CC, Sanders WE Jr, Goering RV, Werner V. Selection of multiple antibioticres istance by quinolones, beta-lactams and aminoglycosydes with special reference to cross-resisitance between unrelated drug classes. Antimicrob Agents and Chemother 1984; 26: 797-801.
49. Green S, Tillot son G. Use of ciprofloxacin in developing countries. Pediatr Infect Dis J 1997; 16: 150-159.
50. Carvajal L, Culasso D. Cepas de Shigella flexneri productoras de beta lactamasa de espectro extendido. La Gaceta del CINDIM 1997; 4: 23.
51. Salam MA, Khan WA, Dhar U, Bennish ML. Randomized, double-blinded comparison of ciprofloxacin suspension and pivamdinocillin tablets in the treatment of shigellosis in children. In: ICCAC. Abstracts Toronto, Ontario. October, 1997. N° LM-17.
52. Therapy for shigellosis II. Randomized, double-nlind comparison of ciprofloxacin and ampicillin. J Infect Dis 1990; 162: 711-716.
53. Bhattacharya SK, Bhattacharya DD, Dutta D, Dutta S, Deb M, Deb A, Das KP, Nair GB. Double-blind, randomized clinicaltrial for safety and efficacy of norfloxacin for shigellosis in children. Acta Paediatr 1997; 86: 319-320.
54. Varsano I, Elditz-marcus T, Nussinovch M, Elian I. Comparative efficacy of ceftriaxone and ampicillin for treatment of severe shigellosis in children. J Pediatr 1991; 118: 627-632.
55. Ashkenazi S, Amir J, Waisman Y, et al. A randomized double-blind study comparing cefixime and trimethoprim-sulfamethoxazole in the treatment of childhood shigellosis. J Pediatr 1993; 123: 817-821.
56. Salam MA, Seas C, Khan WA, Bennish M. Treatnent of shigellosis IV: Cefixime is ineffective in shigellosis in adults. Ann Intern Med 1995; 123: 505-508.
57. Dupont HL, Ericcson Cd, Mathewson JJ, de la Cabada FJ. Oral aztreonam, a poorly absorbed yet effective thjerapy for bacterial diarrhea in US travelers to Mexico. JAMA 1992; 267: 1931-1935.
58. Khan WA, Seas C, Dhar U, Salam MA, Bennish ML. Treatment of shigellosis V. Comparison of azithromycin and ciprofloxacin. Ann Intern Med 1997; 126: 697-703.
59. Murphy GS, Echeverría P, Jackson LR, Arness MK, LeBron C, Pitarangsi ciprofloxacin and azithromycin resistant traveler´s diarrhea in US troops deployed to Thailand in 1994. Clin Infect Dis 1996; 22: 868-869.
60. Retsema J, Girard A, Schelky W, et al. Spectrum and mode of action of azithromycin (CP-62, 993), a new 15-memberedring macrol ide with improved potency against Gramnegative organisms.Antimicrob Agents Chemother 1987; 31: 1939-1947.
61. Lolheka S, Vibulbbandihitkit S, Pooynarit P. Response to antimicrobial therapy for shigellosis in Thailand. Rev Infect Dis 13: S 342-346.
62. Guyon P, Casel-Beraud AM, Rakotonirina G, Gendrel D. Shortterm pefloxacin therapy in Madagascar children with shigellosis due to multiresis tantor aganisms (letter ). Clin Infect Dis 1994; 19: 1172-1173.
63. Bonafede ME, Blumer JL. Role of newer broadspectrum B-lactam and fluroquinolone antibiotics in children. Adv Pediatr Infect Dis 1997; 12:99.
64. Prado D, Lopez E, Liu H, et al. Ceftibuten and trimethoprim-sulfamethoxazole for treatment of Shigella and enteroinvasive Eschertichia coli disease. Pediatr Infect Dis J 1992 ;11: 644-647.
65. Schaad U, et al. Evaluation of the efficacy, safety and toleration of azithromycin vs. Penicillin V in the treatment of acute streptococcal pharyngitis in children: results of a multicenter, open comparative study. Pediatr Infect Dis J 1996; 15: 791-795.
66. O’Doherty G, et al. An open comparative study of azithromycin versus cefaclor in the treatment of patients with upper respiratory tract infections. J Antimicrob Chemother 1996; 37 (Suppl C): 71-81.
67. Rizzato R, et al. Efficacy of a three-day course of azithromycin in moderately severe community-acquired pneumonia Eur Resp J 1995; 8: 398-402.
68. Hoepel man I M, et al. A shor t (3-day) course of azithromycin tablets versus a 10-day course of amoxycillin-clavulanic acid (co-amoxiclav) in the treatment of adults with lower respiratory tract infectionsand effecnts on long-term out comes. Int J Antimicrob Agents 1998; 9: 141-146.
69. Thorpe EM Jr, et al. Chlamydia cervicitis and urethritis: single dose treatment with azithromycin compared with doxycycline for seven days in community based practices. Genitourinary Medicine. The Journal of Sexual Health 1996; 72: 93-97
70. Tomé G, Casellas JM, Gilardoni M. In vitro activity of azithtromycin, erythromycin, clarithromycin and roxithromycin at different pH 4th ICMASK, 1998. Ab 4.33.
71. Iwata S, KamimakiI, Isohata E, et al. Influence of azithromycin on intestinal flora. Jpn J Chemoter 1997; 45: 175-188.

Correspondencia; Centro de Estudios en Antimicrobianos (CEA).
Martinez, Buenos Aires-Argentina.; Alvear 373, CP 1640, Martínez,
Provincia de Buenos Aires, Argentina.; Tel: 5411-4798-1135/5411-47920481