Análisis Preliminares de la Expresión en Membrana de las Proteínas de Choque Térmico de 70 kDa en la Línea Celular k562

A. Barreto1, G. Barrera2, B. Angarita1, R. Avendaño1, S. Quijano3, O. Orozco3, S. Fiorentino1
Grupo de Inmunobiología y Biología Celular.
1Facultad de Ciencias. Departamento de Microbiología.
2Laboratorio de Microscopia Electrónica. CORPOICA.
3Laboratorio de Inmunología. Instituto Nacional de Cancerología, Bogotá, Colombia.

Las proteínas de choque térmico (HSP) participan en la generación de respuesta inmune contra diversos tipos de tumores. La HSP72 (forma inducíble) se puede asociar a péptidos provenientes de la proteólisis intracelular en la célula tumoral, y expresarse en forma directa sobre la membrana donde sirve de blanco de las células asesinas naturales.

Los mecanismos que regulan la expresión de HSP72 en la membrana plasmática no han sido dilucidados aún. El presente trabajo busca analizar la cinética de expresión de la HSP70 inducible y constitutiva en la línea de células tumorales K562 y evaluar los factores externos que pueden jugar un papel en este proceso. La expresión de la HSP70, se indujo a 41.8ºC durante 1, 3 y 3 h 20 m. Las células se incubaron luego a 37ºC durante 2 y 4 h y se determinó la expresión de las proteínas por Inmunofluorescencia indirecta (IFI) utilizando anticuerpos policlonales específicos. Las membranas plasmáticas se purificaron por gradientes de sucrosa y se analizaron por SDS-PAGE al 10% y Western blot.

Se encontró una diferencia en la expresión de las HSPs entre las células mantenidas a 37ºC y las células estresadas por calor. Por IFI, la mayor expresión de HSP72 en membrana y citoplasma (60-80% de las células), se observó a las 3 h de estrés térmico, con un tiempo de recuperación de 4 h a 37ºC. En condiciones fisio-lógicas la HSC70 se encuentra presente en el 40-60% de las células a nivel de citoplasma y su expresión se mantiene igual después del choque térmico.

El análisis electroforético del lisado celular presenta un incremento de las proteínas entre el rango de 60 a 90 kDa de peso molecular, en las células estresadas a 41.8°C. El western blot muestra además una mayor intensidad en las bandas de las proteínas HSP70 y HSC70.

La presencia de estas proteínas se reduce notablemente en las fracciones subcelulares (núcleos, organelos de alto peso molecular y detritos subcelulares). En este trabajo se logró la purificación de membranas plasmáticas tal como se comprobó por microscopía electrónica. Aunque no se logró evidenciar por western blot la HSP72, no se descarta su presencia en las membranas celulares.

Se están haciendo ensayos para optimizar el tiempo de estimulación térmica y de recuperación así como la sensibilidad de los métodos utilizados para poder determinar exactamente la expresión de la proteína en la membrana y la influencia de las citoquinas en este proceso.

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