Estudio de la Amplificación del Oncogén HER2 con Hibridación IN SITU Cromogénica, Materiales y Métodos

Previa aprobación por el comité de ética de la Fundación Valle del Lili, se seleccionaron las muestras de 67 pacientes. El estudio realizado es retrospectivo, descriptivo, no intervencional, del periodo comprendido del año 2010 a abril del 2012. Como criterios de inclusión debían tener carcinoma infiltrante, tener mastectomía, tener representado el tumor en 3 bloques de parafina, tener realizado el estudio por inmunohistoquímica del oncogén HER2 y aquellos casos equívocos (2+) debían tener realizada la hibridación in situ fluorescente (FISH). Los criterios de exclusión fueron trucuts, casos que no hibridaron o pérdida del material en el microarreglo de tejido.

Todas las muestras fueron teñidas con la coloración de hematoxilina y eosina para realizar en ellas el análisis histopatológico, confirmando la presencia de carcinoma infiltrante. Una vez aplicados los criterios de inclusión y exclusión nuestra (n) fue de 42 casos, distribuido así: 18 casos HER2 equivoco (2+), 11 casos HER2 negativos (0 o 1+) y 13 casos HER2 positivos (3+).

Posterior a ello se seleccionaron las áreas en cada muestra para la construcción del microarreglo de tejido, este se construyó según el protocolo estándar del laboratorio de patología molecular de la Fundación Valle del Lili. Una vez realizado el microarreglo, estas muestras fueron cortadas a 4 micras en el micrótomo y montadas en las láminas precargadas (Super Frost Plus Slides), para ser corridas en el equipo automatizado Benchmark XT de Ventana®.

En el ensayo Ventana® HER2 Dual ISH de cocktail de sondas de DNA, la sonda marcada con Dinitrofenol (DNP) y la sonda marcada con Digoxigenina (DIG) son hibridadas simultáneamente en la muestra de tejido. El gen de HER2 se detecta por la sonda marcada con DNP y visualizada utilizando el kit de detección Ventana® ultraView Silver ISH DNP (SISH). El centrómero del Cromosoma 17 se detecta con la sonda marcada con DIG y se visualiza con el kit de detección ultraView Red ISH DIG. Los resultados obtenidos al utilizar este sistema de Detección Dual se observan empleando un microscopio de luz, donde el HER2 aparece en forma de puntos negros (SISH) y el centrómero del Cromosoma 17 como puntos rojos (RED ISH).

Resultados

La cuantificación del nivel de amplificación fue realizada según el protocolo de Ventana® (4,6). Los casos seleccionados como controles positivos fueron 13, ellos corresponden a un 31% de la muestra. La correlación con el Dual ISH e inmunohistoquímica fue del 100%. Los casos seleccionados como negativos fueron 11, ellos corresponden a un 26% de la muestra. La correlación con el Dual ISH e inmunohistoquímica fue del 100%. Nuestros casos equívocos fueron 18, estos corresponden a un 43% de la muestra, de estos el nivel de concordancia solo con el FISH fue de 94.4% (Tabla 1)

Tabla 1. Correlación de la técnica Dual ISH con el FISH en los casos equívocos (2+) por inmunohistoquímica.

	FISH +	FISH-	TOTAL
DISH +	4	0	4
DISH –	1	13	14
TOTAL	5	13	18

La concordancia global como metodología fue de un 98.14% al comparar los casos positivos, negativos y equívocos estudiados por inmunohistoquímica y FISH.

Para la cuantificación de la amplificación del gen HER2 realizamos un ejercicio de lectura conservando el enmascaramiento y comparando a dos evaluadores, uno con experiencia y otro patólogo con poca experiencia, logrando demostrar la reproducibilidad interobservador. El Kappa del evaluador experimentado fue de 0.85 casi perfecto y el Kappa del evaluador poco experimentado fue bueno 0.68. Comparamos el Dual ISH con el FISH encontrando un 17% de discordancia y un Coeficiente de correlación intraclases del 83% en el laboratorio de Patología de la Fundación Valle del Lili (Tabla 2).

Tabla 2. Evaluador 1 (experimentado) con un kappa de 0.85 casi perfecto y el evaluador poco experimentado (2) con un kappa bueno de 0.68, demostrando la reproducibilidad de la Metodología.

	Correlación
	Intraclases/ Kappa FISH	Intraclases/ Kappa 1
Evaluador 1	0.97
Evaluador 1	0.85
Evaluador 2	0.96	0.98
Evaluador 2	0.68	0.98

Discusión

Pudimos implementar esta metodología, verificándola y correlacionado las diferentes metodologías que utilizamos en el laboratorio de patología molecular de la Fundación Valle del Lili. Estas son: hibridación in situ cromogénica y con plata (Dual ISH), hibridación in situ fluorescente (FISH) e inmunohistoquímica con un 98.14% de concordancia, datos similares ya publicados en Europa y Estados Unidos. (2,7)

Nuestro laboratorio es el primero en implementar la técnica Dual ISH y utilizarla para diagnóstico en paciente con cáncer de mama en Colombia, como parte de la práctica clínica diaria. La metodología de lectura es reproducible entre patólogos lo cual pudimos demostrar con nuestro ejercicio, al superar los kappas y la correlación intraclases. Estos datos son correlacionados con los datos ya publicados en el desarrollo de la metodología de lectura del Dual ISH. (2,7,8)

Cuando analizamos el caso discordante (Figura 1), pudimos determinar una cuantificación menor. Como en el estudio de aprobación de la FDA algunos de los casos discordantes fueron validados en un 81% con el diagnostico determinado por Dual ISH en las segunda evaluación de expertos (4). A continuación observamos la tabla comparativa de las dos metodologías. (Tabla 3)

Tabla 3. Comparación del FISH con el Dual ISH.

Técnica	FISH	Dual DISH
Microscopio	Fluorescencia 60-100X	Óptico 20-40-60X
Automatización	Manual, laborioso y personal especializado	Totalmente automatizado
Estudia en la preparación	Simultáneamente HER2 y cromosoma 17	Simultáneamente HER2 y cromosoma 17
Técnica	Entrenamiento, interpretación y cuantitativa	Entrenamiento y cuantitativo
Sensibilidad y especificidad	Alta (98-100%)	Alta (98-97%)
Aprobado FDA	Si	Si BenchMark Ventana®
Archivarse	No	Si
Señal	Decae con el tiempo	Más estable
Colores	2 a 4 sondas de diferente color	2 colores
Evaluación morfológica	Limitada	Buena
Costo	Alto	Medio-bajo
Tiempo de proceso	Más de 24 horas	12 horas