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Estudio de la Amplificación del Oncogén HER2 con Hibridación IN SITU Cromogénica, Materiales y Métodos

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Previa aprobación por el comité de ética de la Fundación Valle del Lili, se seleccionaron las muestras de 67 pacientes. El estudio realizado es retrospectivo, descriptivo, no intervencional, del periodo comprendido del año 2010 a abril del 2012. Como criterios de inclusión debían tener carcinoma infiltrante, tener mastectomía, tener representado el tumor en 3 bloques de parafina, tener realizado el estudio por inmunohistoquímica del oncogén HER2 y aquellos casos equívocos (2+) debían tener realizada la hibridación in situ fluorescente (FISH). Los criterios de exclusión fueron trucuts, casos que no hibridaron o pérdida del material en el microarreglo de tejido.

Todas las muestras fueron teñidas con la coloración de hematoxilina y eosina para realizar en ellas el análisis histopatológico, confirmando la presencia de carcinoma infiltrante. Una vez aplicados los criterios de inclusión y exclusión nuestra (n) fue de 42 casos, distribuido así: 18 casos HER2 equivoco (2+), 11 casos HER2 negativos (0 o 1+) y 13 casos HER2 positivos (3+).

Encuesta sobre Vehículos en Colombia 🚘 🛣️

¡Bienvenido(a)!

Gracias por participar en esta encuesta. Su opinión es muy valiosa para conocer la percepción que tienen los consumidores sobre diferentes marcas de vehículos en Colombia. La encuesta es anónima y sus respuestas serán utilizadas únicamente con fines de investigación de mercado.

⏰ Duración estimada: 5 minutos.

Por favor, responda con sinceridad.

1. Ciudad de residencia*

Si no aparece su ciudad, por favor especifique cuál. 

1. Ciudad de residencia*

Si no aparece su ciudad, por favor especifique cuál. 

2. Género   *

2. Género   *

3. Edad*

3. Edad*

4. Estrato socioeconómico (NSE)*

4. Estrato socioeconómico (NSE)*

5. ¿Cuál es la primera marca que viene a su mente cuando piensa en vehículos?

5. ¿Cuál es la primera marca que viene a su mente cuando piensa en vehículos?

6. ¿Qué otras marcas de vehículos vienen a su mente?

6. ¿Qué otras marcas de vehículos vienen a su mente?

7. ¿Qué otras marcas de vehículos (Camionetas, SUV, automóviles, pickups / camionetas de platón) vienen a su mente?

7. ¿Qué otras marcas de vehículos (Camionetas, SUV, automóviles, pickups / camionetas de platón) vienen a su mente?

8. De las siguientes marcas de vehículos, ¿cuáles recuerda haber visto o escuchado?*

8. De las siguientes marcas de vehículos, ¿cuáles recuerda haber visto o escuchado?*

9. ¿Qué tanto conoce cada una de estas marcas de vehículos?*

Por favor responda sobre cada marca.

9. ¿Qué tanto conoce cada una de estas marcas de vehículos?*

Por favor responda sobre cada marca.

Nada Conocido
Algo conocido
Muy conocido
Chery
Changan
Deepal
BYD
Geely
Great Wall
Jetour
MG
Zeekr

10. ¿De qué marca de vehículos recuerda haber visto, escuchado o leído publicidad recientemente?*

10. ¿De qué marca de vehículos recuerda haber visto, escuchado o leído publicidad recientemente?*

11. ¿De qué otras marcas de vehículos ha visto publicidad?

11. ¿De qué otras marcas de vehículos ha visto publicidad?

12. ¿En qué lugar o medio recuerda haber visto, leído o escuchado sobre estas marcas?

Chery - Changan - Deepal - BYD - Geely - Great Wall - Jetour - MG - Zeekr

12. ¿En qué lugar o medio recuerda haber visto, leído o escuchado sobre estas marcas?

Chery - Changan - Deepal - BYD - Geely - Great Wall - Jetour - MG - Zeekr

13. ¿Qué tanta publicidad ha visto de cada marca?*

Por favor responda sobre cada marca.

13. ¿Qué tanta publicidad ha visto de cada marca?*

Por favor responda sobre cada marca.

Nada
Poca
Mucha
Chery
Changan
Deepal
BYD
Geely
Great Wall
Jetour
MG
Zeekr
14. ¿Qué tan familiarizado(a) está con estas marcas?

Chery*

Chery*

Changan*

Changan*

Deepal*

Deepal*

BYD*

BYD*

Geely*

Geely*

Great Wall*

Great Wall*

Jetour*

Jetour*

MG*

MG*

Zeekr*

Zeekr*

15. ¿Qué palabras o atributos asocia con estas marcas?

Chery

Chery

Changan

Changan

Deepal

Deepal

BYD

BYD

Geely

Geely

Great Wall

Great Wall

Jetour

Jetour

MG 

MG 

Zeekr

Zeekr

16. ¿Cuál es su percepción general de estas marcas?*

16. ¿Cuál es su percepción general de estas marcas?*

Negativa
Neutral
Positiva
Chery
Changan
Deepal
BYD
Geely
Great Wall
Jetour
MG
Zeekr

17. ¿Ha comprado vehículos de estas marcas anteriormente?*

17. ¿Ha comprado vehículos de estas marcas anteriormente?*

No
Chery
Changan
Deepal
BYD
Geely
Great Wall
Jetour
MG
Zeekr

18. ¿Qué tan probable es que compre un vehículo de estas marcas en el futuro?*

18. ¿Qué tan probable es que compre un vehículo de estas marcas en el futuro?*

Muy improbable
Algo probable
Muy probable
Chery
Changan
Deepal
BYD
Geely
Great Wall
Jetour
MG
Zeekr

Posterior a ello se seleccionaron las áreas en cada muestra para la construcción del microarreglo de tejido, este se construyó según el protocolo estándar del laboratorio de patología molecular de la Fundación Valle del Lili. Una vez realizado el microarreglo, estas muestras fueron cortadas a 4 micras en el micrótomo y montadas en las láminas precargadas (Super Frost Plus Slides), para ser corridas en el equipo automatizado Benchmark XT de Ventana®.

En el ensayo Ventana® HER2 Dual ISH de cocktail de sondas de DNA, la sonda marcada con Dinitrofenol (DNP) y la sonda marcada con Digoxigenina (DIG) son hibridadas simultáneamente en la muestra de tejido. El gen de HER2 se detecta por la sonda marcada con DNP y visualizada utilizando el kit de detección Ventana® ultraView Silver ISH DNP (SISH). El centrómero del Cromosoma 17 se detecta con la sonda marcada con DIG y se visualiza con el kit de detección ultraView Red ISH DIG. Los resultados obtenidos al utilizar este sistema de Detección Dual se observan empleando un microscopio de luz, donde el HER2 aparece en forma de puntos negros (SISH) y el centrómero del Cromosoma 17 como puntos rojos (RED ISH).

Resultados

La cuantificación del nivel de amplificación fue realizada según el protocolo de Ventana® (4,6). Los casos seleccionados como controles positivos fueron 13, ellos corresponden a un 31% de la muestra. La correlación con el Dual ISH e inmunohistoquímica fue del 100%. Los casos seleccionados como negativos fueron 11, ellos corresponden a un 26% de la muestra. La correlación con el Dual ISH e inmunohistoquímica fue del 100%. Nuestros casos equívocos fueron 18, estos corresponden a un 43% de la muestra, de estos el nivel de concordancia solo con el FISH fue de 94.4% (Tabla 1)

Tabla 1. Correlación de la técnica Dual ISH con el FISH en los casos equívocos (2+) por inmunohistoquímica.

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  FISH + FISH- TOTAL
DISH + 4 0 4
DISH – 1 13 14
TOTAL 5 13 18

La concordancia global como metodología fue de un 98.14% al comparar los casos positivos, negativos y equívocos estudiados por inmunohistoquímica y FISH.

Para la cuantificación de la amplificación del gen HER2 realizamos un ejercicio de lectura conservando el enmascaramiento y comparando a dos evaluadores, uno con experiencia y otro patólogo con poca experiencia, logrando demostrar la reproducibilidad interobservador. El Kappa del evaluador experimentado fue de 0.85 casi perfecto y el Kappa del evaluador poco experimentado fue bueno 0.68. Comparamos el Dual ISH con el FISH encontrando un 17% de discordancia y un Coeficiente de correlación intraclases del 83% en el laboratorio de Patología de la Fundación Valle del Lili (Tabla 2).

Tabla 2. Evaluador 1 (experimentado) con un kappa de 0.85 casi perfecto y el evaluador poco experimentado (2) con un kappa bueno de 0.68, demostrando la reproducibilidad de la Metodología.

  Correlación
  Intraclases/
Kappa FISH
Intraclases/
Kappa 1
Evaluador 1 0.97          
Evaluador 1 0.85             
Evaluador 2 0.96 0.98
Evaluador 2 0.68 0.98

Discusión

Pudimos implementar esta metodología, verificándola y correlacionado las diferentes metodologías que utilizamos en el laboratorio de patología molecular de la Fundación Valle del Lili. Estas son: hibridación in situ cromogénica y con plata (Dual ISH), hibridación in situ fluorescente (FISH) e inmunohistoquímica con un 98.14% de concordancia, datos similares ya publicados en Europa y Estados Unidos. (2,7)

Nuestro laboratorio es el primero en implementar la técnica Dual ISH y utilizarla para diagnóstico en paciente con cáncer de mama en Colombia, como parte de la práctica clínica diaria. La metodología de lectura es reproducible entre patólogos lo cual pudimos demostrar con nuestro ejercicio, al superar los kappas y la correlación intraclases. Estos datos son correlacionados con los datos ya publicados en el desarrollo de la metodología de lectura del Dual ISH. (2,7,8)

Cuando analizamos el caso discordante (Figura 1), pudimos determinar una cuantificación menor. Como en el estudio de aprobación de la FDA algunos de los casos discordantes fueron validados en un 81% con el diagnostico determinado por Dual ISH en las segunda evaluación de expertos (4). A continuación observamos la tabla comparativa de las dos metodologías. (Tabla 3)

Tabla 3. Comparación del FISH con el Dual ISH.

Técnica

FISH Dual DISH
Microscopio Fluorescencia
60-100X
Óptico
20-40-60X
Automatización Manual, laborioso y personal especializado Totalmente automatizado
Estudia en la preparación Simultáneamente HER2 y cromosoma 17 Simultáneamente HER2 y cromosoma 17
Técnica Entrenamiento, interpretación y cuantitativa Entrenamiento y cuantitativo
Sensibilidad y especificidad Alta (98-100%) Alta (98-97%)
Aprobado FDA Si Si
BenchMark Ventana®
Archivarse No Si
Señal Decae con el tiempo Más estable
Colores 2 a 4 sondas de diferente color 2 colores
Evaluación morfológica Limitada Buena
Costo Alto Medio-bajo
Tiempo de proceso Más de 24 horas 12 horas

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