Efecto del Hidroxido de Calcio a Nivel Intracelular

* Dr. Jairo Sarmiento Morin
Odontólogo profesor de la Universidad Nacional de Colombia
** Dr. Carlos Arturo Guerrero
Médico Profesor Universidad Nacional de Colombia
*** Dr. Néstor Arciniégas A.
Odontólogo Profesor Universidad Nacional de Colombia

INTRODUCCIÓN:

El hidróxido de Calcio ha sido ampliamente utilizado en Odontología desde que el doctor Hermann lo introdujo en 1920 combinado con otros materiales(1). Inicialmente se usó como apósito en cavidades profundas y exposiciones pulpares, (2); en las dos últimas décadas se le ha dado una aplicación diferente de coadyuvante en la terapéutica endodóntica como obturación temporal entre sesiones; desde ese tiempo se comenzaron a estudiar las propiedades químicas y biológicas del medicamento. Teusher en 1938 y Glass en 1949 observaron la conversión de células mesenquimatosas en los tejidos conectivos cuando se les ponía en contacto con el medicamento.

En la literatura odontológica existe una amplia y detallada revisión bibliográfica sobre el tema, por esto hoy en día podemos desglosar en forma detallada la mayoría de las propiedades del hidróxido de calcio. La primera es la alcalinidad del medicamento (pH 12.5); el Doctor Tronstand en 1981 observó como a los tejidos dentales se les eleva el pH cuando los conductos radiculares se obturan con hidróxido de calcio(3). El cree que dicho cambio del medio ambiente de los tejidos dentales es benéfico: primero inhibe actividad osteoclástica; y segundo, de alguna manera aún no clara, activa los procesos reparativos por activación osteoblástica(4). Una segunda propiedad es la antibacteriana, por su elevado pH puede esterilizar hasta en un 88% los conductos radiculares según lo reportado por los doctores Cvek en 1976(5), Binnie y Rowe, (6). Otra propiedad es su acción antiexudativa que intenta explicarla por la disminución de la permeabilidad capilar gracias a la presencia de los iones de calcio, lo que decrece la extravasación de plasma, por eso en los procesos inflamatorios se disminuye el dolor(7).

También se le reconocen capacidades osteogénicas por su capacidad de estimular la mineralización de los tejidos conectivos; han especulado que obedece al ión hidróxilo por la elevación del pH, o al otro componente del medicamento, el ión calcio, pero este por sí solo no produce mineralización, y la propuesta hasta ahora más aceptada es la acción combinada de los componentes que finalmente se traduce en una acción similar a la mineralización fisiológica de los tejidos conectivos duros(8). En síntesis, se conoce como un estimulador o un acelerador de la mineralización, aunque el mecanismo no está dilucidado. Sobre el tejido pulpar esta acción se hace evidente al producir un efecto casuístico que ocasiona una respuesta inflamatoria moderada y localizada. Posteriormente hay estimulación de células mesenquimales, fibroblastos y de defensa, las cuales comienzan la formación de una matriz de tejido conectivo con neoformación de fibras colágenas sobre las cuales se van a formar los cristales de hidroxiapatita para comenzar la mineralización. Se postula que esto ocurre gracias a la alta concentración de iones de calcio y a la elevación del pH para estimular las fosfatasas alcalinas, lo que se traduce en la formación de una barrera en la formación de una barrera de tejido duro (conjuntivo denso, mineralización)(9), (10), (11), (12).

A pesar de los anteriores estudios no hay una demostración de como el hidróxido de calcio lleva a cabo este proceso tisular y su aplicación clínica se puede considerar empírica, basada en la eficacia del hidróxido de calcio como acelerador de los procesos reparativos del complejo pulpodentario.

Por sus acciones a nivel clínico se ha postulado la hipótesis de que el hidróxido de calcio es potencialmente mitogénico en los tejidos conectivos. El doctor Torneck y Col. evaluaron el efecto del hidróxido de calcio sobre fibroblastos pulpares de porcinos evaluando la capacidad mitogénica de diferentes concentraciones del medicamento mediante la medición de síntesis de DNA por cuantificación de Timidina Tritiada. Los resultados del estudio mostraron incremento en la incorporación de Timinida Tritiada que intentan hacerla significativa con tratamiento estadístico.

Lo anterior les lleva a pensar que hay una aceleración en la síntesis de DNA porque las células que recibieron hidróxido de calcio incorporaron más Timidina Tritiada. De otro lado se ha observado un incremento de la división celular cuando se aplicaron apósitos del medicamento en contacto directo con el tejido pulpar(13).

El presente estudio es un intento de evaluar los efectos del hidróxido de calcio sobre la división celular medido por el síntesis de DNA en linfocitos de sangre periférica mediante incorporación de Timidina Tritiada, y para corroborar los hallazgos se evaluó la viabilidad celular usando Tripan Azul, al igual que la coloración Giemsa para observar la estructura celular en cuanto a su relación núcleo-citoplasma.

De esta manera evaluamos el efecto in vitro del hidróxido de calcio en la integralidad celular y demostramos que si efecto es una lisis celular, directamente proporcional a la concentración de hidróxido de calcio adicionado al medio.

Igualmente demostramos, que como molécula el hidróxido de calcio no puede tener un efecto mitogénico ni proliferativo por la lisis celular demostrada in vitro y probablemente tampoco in vivo dado que las cantidades utilizadas en el paciente, son mayores a las empleadas en esta etapa in vitro.

MARCO TEÓRICO

Cuando a un medicamento se le atribuyen propiedades mitogénicas o estimuladoras del ciclo celular, como ocurre con el hidróxido de calcio, debemos comprobar esta capacidad, para entenderla mejor y por ésto desglosamos el ciclo celular que es una propiedad imprescindible de todas las células vivas, y es la capacidad de duplicar su DNA genómico y transmitir copias idénticas de su información genética a cada célula hija. El ciclo de proliferación celular abarca dos períodos:

1. División celular, como su nombre lo indica, comprende la división de la célula y la separación de las células hijas;
2. Interfase o periodo de crecimiento celular

La replicación del DNA sólo se dá en la fase de síntesis. Antes y después de la fase S hay dos intervalos (gap) G1 y G2, en los que no hay síntesis de DNA. Durante el período G2, la célula contiene dos copias porque acaba de replicar su DNA en síntesis. A lo largo de la interfase, hay un crecimiento celular continuo y síntesis de otras macromoléculas celulares, tales como RNA, proteínas y membranas

Durante G2 la célula se prepara acumulando macromoléculas implicadas en la condensación del DNA. Desensamble y ensamble de estructuras implicadas en el periodo mitótico (M), es un proceso complejo en que se distribuyen los cromosomas equitativamente entre las células hijas.

Las células somáticas diferenciadas de mamíferos pueden tener índices de crecimiento, sin embargo, los periodos S, G2 y M, son bastantes constantes (alrededor de 7h, 3h y 1h respectivamente), el período más variable es G1, el cual puede durar desde 2-3h hasta muchos días. Las células en cultivo que han agotado una hormona o nutrientes necesarios dejan de crecer, y su DNA no se replica, se detiene en una fase del ciclo celular llamado GO. (Este período no se llama G1 porque las células no están preparadas, ni preparándose para la replicación del DNA). La estipulación de éstas células para reanudar el crecimiento se da mediante la adición al medio de una sustancia que estimula a la célula a volver a G1. Las sustancias que tienen esta propiedad son mitogénicas.

Así mismo existen algunas sustancias que aceleran el ciclo celular una vez están en G1, pero no lo hacen si la célula está en GO. Estas sustancias no son mitogénicas sino estimuladoras del ciclo celular.(14), (15).

Para medir la capacidad mitogénica o estimuladora del ciclo celular de un medicamento se puede utilizar la técnica de la rata de incorporación de Timidina Tritiada en cultivos celulares, que nos indica la velocidad de síntesis del DNA(18).

En el estudio el Doctor Torneck, utilizó esta técnica para analizar la síntesis de DNA en fibroblastos pulpares de porcinos(14). El cultivo se realizó en una incubadora con atmósfera húmeda con un 5% de dióxido de carbono a 37 grados centígrados. A los cuatro días se les adicionó Tripsina disuelta en Citrato Salino pH 7.8 durante 5 min. Las células de suspensión fueron pipetiadas a un tubo con medio de cultivo MEM y 15% de suero fetal bovino. Posteriormente se centrifugó para separar las células y se cultivaron en frascos individuales cada uno de los cuales tenía una concentración de 4 x 104 células/, ml.

Para la preparación de la solución del hidróxido de calcio se utilizó 0.00121 gr de hidróxido de calcio disuelto en 10 ml de agua destilada a 23 grados centígrados quedando una concentración del ión calcio de 0.1137 gr/100ml.

Posteriormente centrifugó por 5 min y filtró en membrana de 0.22 um.

A los cultivos de fibroblasto les agregó 0.025 ml a un primer grupo de 0.050 ml al segundo grupo, dejando un tercero como control. La evaluación la realizó a las 18 horas de cultivo. Reportando una diferencia no significativa en las diferentes concentraciones del medicamento. Cuando se estudian las propiedades del medicamento debemos tener en cuenta otros factores tales como un pH alto, que puede alterar la estructura celular, debe corroborarse la integridad celular con otras técnicas como los colorantes Giemsa y Tripan Azul que sirvan para evaluar la estabilidad de la estructura y viabilidad de las células respectivamente.

El Giemsa es un colorante utilizado en citogenética, que tiene la propiedad de unirse fundamentalmente a proteínas de la cromatina y dado que la cromatina está en el núcleo, permite diferenciar entre el núcleo, permite diferenciar entre el núcleo y el citoplasma(16), (17). Aprovechando esta propiedad del colorante, se utilizó para observar el efecto de hidróxido de calcio sobre la estructura celular.

El Tripan azul es un colorante que tiene la propiedad de ingresar a las células no viables mientras que las células viables lo rechazan.

Por medio de esta coloración se puede determinar el porcentaje de viabilidad celular después de aplicado un medicamento sobre un cultivo celular de acuerdo al protocolo utilizado en la Unidad Genética de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Colombia.

Las pruebas se realizaron in vitro en cultivo celular. Los estudios a nivel de éstos, se realizan con diferentes variables, bien sea aislando células de los tejidos vivos o bien utilizando líneas celulares ya establecidas. En nuestro estudio estas se utilizan porque tienen ventajas como: proceder de un solo clon y ser homogéneas en sus características geno y fenotípicas.

Además el cultivo in vitro permite controlar las condiciones fisicoquímicas (pH, temperatura, presión osmótica, tensión de O2 y CO2) y fisiológicas(18), para hacer reproducible los experimentos.

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