Efecto del Hidroxido de Calcio a Nivel Intracelular

* Dr. Jairo Sarmiento Morin
Odontólogo profesor de la Universidad Nacional de Colombia
** Dr. Carlos Arturo Guerrero
Médico Profesor Universidad Nacional de Colombia
*** Dr. Néstor Arciniégas A.
Odontólogo Profesor Universidad Nacional de Colombia

INTRODUCCIÓN:

El hidróxido de Calcio ha sido ampliamente utilizado en Odontología desde que el doctor Hermann lo introdujo en 1920 combinado con otros materiales(1). Inicialmente se usó como apósito en cavidades profundas y exposiciones pulpares, (2); en las dos últimas décadas se le ha dado una aplicación diferente de coadyuvante en la terapéutica endodóntica como obturación temporal entre sesiones; desde ese tiempo se comenzaron a estudiar las propiedades químicas y biológicas del medicamento. Teusher en 1938 y Glass en 1949 observaron la conversión de células mesenquimatosas en los tejidos conectivos cuando se les ponía en contacto con el medicamento.

En la literatura odontológica existe una amplia y detallada revisión bibliográfica sobre el tema, por esto hoy en día podemos desglosar en forma detallada la mayoría de las propiedades del hidróxido de calcio. La primera es la alcalinidad del medicamento (pH 12.5); el Doctor Tronstand en 1981 observó como a los tejidos dentales se les eleva el pH cuando los conductos radiculares se obturan con hidróxido de calcio(3). El cree que dicho cambio del medio ambiente de los tejidos dentales es benéfico: primero inhibe actividad osteoclástica; y segundo, de alguna manera aún no clara, activa los procesos reparativos por activación osteoblástica(4). Una segunda propiedad es la antibacteriana, por su elevado pH puede esterilizar hasta en un 88% los conductos radiculares según lo reportado por los doctores Cvek en 1976(5), Binnie y Rowe, (6). Otra propiedad es su acción antiexudativa que intenta explicarla por la disminución de la permeabilidad capilar gracias a la presencia de los iones de calcio, lo que decrece la extravasación de plasma, por eso en los procesos inflamatorios se disminuye el dolor(7).

También se le reconocen capacidades osteogénicas por su capacidad de estimular la mineralización de los tejidos conectivos; han especulado que obedece al ión hidróxilo por la elevación del pH, o al otro componente del medicamento, el ión calcio, pero este por sí solo no produce mineralización, y la propuesta hasta ahora más aceptada es la acción combinada de los componentes que finalmente se traduce en una acción similar a la mineralización fisiológica de los tejidos conectivos duros(8). En síntesis, se conoce como un estimulador o un acelerador de la mineralización, aunque el mecanismo no está dilucidado. Sobre el tejido pulpar esta acción se hace evidente al producir un efecto casuístico que ocasiona una respuesta inflamatoria moderada y localizada. Posteriormente hay estimulación de células mesenquimales, fibroblastos y de defensa, las cuales comienzan la formación de una matriz de tejido conectivo con neoformación de fibras colágenas sobre las cuales se van a formar los cristales de hidroxiapatita para comenzar la mineralización. Se postula que esto ocurre gracias a la alta concentración de iones de calcio y a la elevación del pH para estimular las fosfatasas alcalinas, lo que se traduce en la formación de una barrera en la formación de una barrera de tejido duro (conjuntivo denso, mineralización)(9), (10), (11), (12).

A pesar de los anteriores estudios no hay una demostración de como el hidróxido de calcio lleva a cabo este proceso tisular y su aplicación clínica se puede considerar empírica, basada en la eficacia del hidróxido de calcio como acelerador de los procesos reparativos del complejo pulpodentario.

Por sus acciones a nivel clínico se ha postulado la hipótesis de que el hidróxido de calcio es potencialmente mitogénico en los tejidos conectivos. El doctor Torneck y Col. evaluaron el efecto del hidróxido de calcio sobre fibroblastos pulpares de porcinos evaluando la capacidad mitogénica de diferentes concentraciones del medicamento mediante la medición de síntesis de DNA por cuantificación de Timidina Tritiada. Los resultados del estudio mostraron incremento en la incorporación de Timinida Tritiada que intentan hacerla significativa con tratamiento estadístico.

Lo anterior les lleva a pensar que hay una aceleración en la síntesis de DNA porque las células que recibieron hidróxido de calcio incorporaron más Timidina Tritiada. De otro lado se ha observado un incremento de la división celular cuando se aplicaron apósitos del medicamento en contacto directo con el tejido pulpar(13).

El presente estudio es un intento de evaluar los efectos del hidróxido de calcio sobre la división celular medido por el síntesis de DNA en linfocitos de sangre periférica mediante incorporación de Timidina Tritiada, y para corroborar los hallazgos se evaluó la viabilidad celular usando Tripan Azul, al igual que la coloración Giemsa para observar la estructura celular en cuanto a su relación núcleo-citoplasma.

De esta manera evaluamos el efecto in vitro del hidróxido de calcio en la integralidad celular y demostramos que si efecto es una lisis celular, directamente proporcional a la concentración de hidróxido de calcio adicionado al medio.

Igualmente demostramos, que como molécula el hidróxido de calcio no puede tener un efecto mitogénico ni proliferativo por la lisis celular demostrada in vitro y probablemente tampoco in vivo dado que las cantidades utilizadas en el paciente, son mayores a las empleadas en esta etapa in vitro.

MARCO TEÓRICO

Cuando a un medicamento se le atribuyen propiedades mitogénicas o estimuladoras del ciclo celular, como ocurre con el hidróxido de calcio, debemos comprobar esta capacidad, para entenderla mejor y por ésto desglosamos el ciclo celular que es una propiedad imprescindible de todas las células vivas, y es la capacidad de duplicar su DNA genómico y transmitir copias idénticas de su información genética a cada célula hija. El ciclo de proliferación celular abarca dos períodos:

1. División celular, como su nombre lo indica, comprende la división de la célula y la separación de las células hijas;
2. Interfase o periodo de crecimiento celular

La replicación del DNA sólo se dá en la fase de síntesis. Antes y después de la fase S hay dos intervalos (gap) G1 y G2, en los que no hay síntesis de DNA. Durante el período G2, la célula contiene dos copias porque acaba de replicar su DNA en síntesis. A lo largo de la interfase, hay un crecimiento celular continuo y síntesis de otras macromoléculas celulares, tales como RNA, proteínas y membranas

Durante G2 la célula se prepara acumulando macromoléculas implicadas en la condensación del DNA. Desensamble y ensamble de estructuras implicadas en el periodo mitótico (M), es un proceso complejo en que se distribuyen los cromosomas equitativamente entre las células hijas.

Las células somáticas diferenciadas de mamíferos pueden tener índices de crecimiento, sin embargo, los periodos S, G2 y M, son bastantes constantes (alrededor de 7h, 3h y 1h respectivamente), el período más variable es G1, el cual puede durar desde 2-3h hasta muchos días. Las células en cultivo que han agotado una hormona o nutrientes necesarios dejan de crecer, y su DNA no se replica, se detiene en una fase del ciclo celular llamado GO. (Este período no se llama G1 porque las células no están preparadas, ni preparándose para la replicación del DNA). La estipulación de éstas células para reanudar el crecimiento se da mediante la adición al medio de una sustancia que estimula a la célula a volver a G1. Las sustancias que tienen esta propiedad son mitogénicas.

Así mismo existen algunas sustancias que aceleran el ciclo celular una vez están en G1, pero no lo hacen si la célula está en GO. Estas sustancias no son mitogénicas sino estimuladoras del ciclo celular.(14), (15).

Para medir la capacidad mitogénica o estimuladora del ciclo celular de un medicamento se puede utilizar la técnica de la rata de incorporación de Timidina Tritiada en cultivos celulares, que nos indica la velocidad de síntesis del DNA(18).

En el estudio el Doctor Torneck, utilizó esta técnica para analizar la síntesis de DNA en fibroblastos pulpares de porcinos(14). El cultivo se realizó en una incubadora con atmósfera húmeda con un 5% de dióxido de carbono a 37 grados centígrados. A los cuatro días se les adicionó Tripsina disuelta en Citrato Salino pH 7.8 durante 5 min. Las células de suspensión fueron pipetiadas a un tubo con medio de cultivo MEM y 15% de suero fetal bovino. Posteriormente se centrifugó para separar las células y se cultivaron en frascos individuales cada uno de los cuales tenía una concentración de 4 x 104 células/, ml.

Para la preparación de la solución del hidróxido de calcio se utilizó 0.00121 gr de hidróxido de calcio disuelto en 10 ml de agua destilada a 23 grados centígrados quedando una concentración del ión calcio de 0.1137 gr/100ml.

Posteriormente centrifugó por 5 min y filtró en membrana de 0.22 um.

A los cultivos de fibroblasto les agregó 0.025 ml a un primer grupo de 0.050 ml al segundo grupo, dejando un tercero como control. La evaluación la realizó a las 18 horas de cultivo. Reportando una diferencia no significativa en las diferentes concentraciones del medicamento. Cuando se estudian las propiedades del medicamento debemos tener en cuenta otros factores tales como un pH alto, que puede alterar la estructura celular, debe corroborarse la integridad celular con otras técnicas como los colorantes Giemsa y Tripan Azul que sirvan para evaluar la estabilidad de la estructura y viabilidad de las células respectivamente.

El Giemsa es un colorante utilizado en citogenética, que tiene la propiedad de unirse fundamentalmente a proteínas de la cromatina y dado que la cromatina está en el núcleo, permite diferenciar entre el núcleo, permite diferenciar entre el núcleo y el citoplasma(16), (17). Aprovechando esta propiedad del colorante, se utilizó para observar el efecto de hidróxido de calcio sobre la estructura celular.

El Tripan azul es un colorante que tiene la propiedad de ingresar a las células no viables mientras que las células viables lo rechazan.

Por medio de esta coloración se puede determinar el porcentaje de viabilidad celular después de aplicado un medicamento sobre un cultivo celular de acuerdo al protocolo utilizado en la Unidad Genética de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Colombia.

Las pruebas se realizaron in vitro en cultivo celular. Los estudios a nivel de éstos, se realizan con diferentes variables, bien sea aislando células de los tejidos vivos o bien utilizando líneas celulares ya establecidas. En nuestro estudio estas se utilizan porque tienen ventajas como: proceder de un solo clon y ser homogéneas en sus características geno y fenotípicas.

Además el cultivo in vitro permite controlar las condiciones fisicoquímicas (pH, temperatura, presión osmótica, tensión de O2 y CO2) y fisiológicas(18), para hacer reproducible los experimentos.

MATERIALES Y MÉTODOS

Cultivo de fibroblastos BHK

La línea celular BHK en RPMI con SFB al 10% fue desprendida por Tripsina según técnica realizada por Torneck y contada en cámara de Newbauer para hacer alicuotas de 100.000 células ml/0./ repartidas en ocho pozos en caja de 96 pozos.

PRUEBAS REALIZADAS

Incorporación de Timidina Tritiada:

Se utilizó timidina Tritiada adquirida en laboratorios SIGMA, a una concentración de 1 Uc/100.000 células. La Timidina se adicionó al total de células antes de alicuotarlas, con el objeto de homogenizar la distribución; y al azar se eligen los controles que no recibirán tratamiento con hidróxido de calcio.

El hidróxido de calcio fue obtenido del laboratorio GENFAR. Se tomaron 0.0125 gr de hidróxido de calcio y se disolvió en 10 ml de agua con un pH de 12.3 a temperatura ambiente aproximadamente 15 grados centígrados.

Se tomaron las siguientes alicuotas:

10 ul (0.125 mg); 20 ul (0.25mg): 100 ul (1.25mg); 250 ul (3.125 mg) 500 ul (6.25 mg) para adicionarlo, por triplicado a las células alicuotas que tenían Timidina tritiada. A los tres pozos control no se les adicionó hidróxido de calcio y se dejaron solo con Timidina Tritiada y células.

Las células fueron cultivadas durante 24 horas en medio RPMI y SFB al 10%. En la cosecha, las células se lavaron 3 veces con PSB y se pasaron a 5 ml de líquido de centelleo para ser contadas en un contador Backman.

VIABILIDAD CELULAR:

A las alicuotas de BHK se les adicionó por duplicado las mismas concentraciones de hidróxido de calcio antes mencionadas en linfocitos. Para determinar el porcentaje de células viables se utilizó el colorante Tripan Azul. Dicho porcentaje se observó en cámara de Newbauer al microscopio invertido.

COLORACION GIEMSA:

Alicuotas de BHK que recibieron las concentraciones de hidróxido de calcio antes señaladas se lavaron 3 veces con PBS. El pellet se extendió en láminas de vidrio que se secaron a 37 grados centígrados y durante dos horas se fijaron en Metanol-Acido Acético (3:1) durante 30 minutos. Se adicionó colorante Giemsa durante 5 minutos y las células fueron analizadas en microscopio de luz.

Incorporación de Timidina Tritiada

Las alicuotas de fibroblastos BHK cultivados de fibroblastos BHK cultivados en RPMI, con SFB al 10% y durante 24 horas, que recibieron Timidina Tritiada e Hidróxido de Calcio en diferentes concentraciones, luego de lavarse 3 veces con PBS y adicionarse en 5 ml de líquido de centelleo presentaron los resultados listados en la Tabla No. 1.

Como se puede observar, la incorporación de Timidina Tritiada en las células que recibieron hidróxido de calcio, es menor a las de las células control, (aquellas que recibieron hidróxido de calcio). Entre las muestras con tratamiento no existen grandes diferencias respecto a la incorporación de Timidina Tritiada. (Gráfica No. 1).

Estos resultados no variaron en 3 experimentos repetidos con el mismo tipo de células no estimuladas, es decir que no recibieron fitohemaglutinina (PHA), un mitógeno conocido. Así mismo un experimento realizado en células estimuladoras con pHAm arrojó resultados similares a los de células no estimuladas.

VIABILIDAD CELULAR:

Las alicuotas de BHK fueron divididas en dos grandes grupos para tratamiento con hidróxido de calcio. El primer grupo recibió la concentración indicada en una sola dosis y contada, al cabo de 5 horas con el colorante Tripan Azul. Al segundo grupo, la misma concentración de hidróxido de calcio se fraccionó, adicionando 1/5 de la concentración cada hora durante 5 horas, al cabo de las cuales se hizo el conteo con el colorante. Los resultados, Tabla 2 – Gráfica 2, muestran que en las concentraciones 6.25 mg (500ul) y 3.125 mg (250ul) hay 100% de células no viables; en la concentración 1.25 mg (100ul) el 47% de células son viables, con 0.25 mg (20 ul) son viables el 74-82%.

Cuando se comparan las dosis fraccionadas con dosis única, se observa que no hay ninguna diferencia significativa al final del tratamiento, es decir, cuando se analiza la viabilidad al cabo de las cinco horas de tratamiento con dosis única y fraccionada. No obstante si se analiza la dosis fraccionada, en la primera hora de tratamiento sí se observa diferencia pero debe tenerse en cuenta que no es equivalente, puesto que tienen 1/5 de la dosis única.

COLORACION GIEMSA:

Las alicuotas de BHK, fueron divididas en dos grupos para tratamiento con hidróxido de calcio, de manera similar al estudio para viabilidad celular.

Una vez teñidas las células con el colorante Giemsa, fueron observadas al microscopio con lente 10 x 100 x encontrándose los resultados de la Tabla 3 y Gráfico No. 3.

La primera alicuota de BHK recibió la concentración total y se contó a la hora y a las 5 horas y la segunda alicuota recibió la dosis fraccionada y se dejó a las cinco horas alcanzaron las tres lecturas no se encontraron diferencias en las 3 y se observa un comportamiento homogéneo total mitohomogéneo es decir a dosis elevada, (100-250-500 microlitros) el porcentaje de células íntegras es casi de 0 y en las dosis menores de Ca (OH)2 el porcentaje de células viables se aumentó considerablemente

CONCLUSIONES TIMIDINA

1. Con ninguna dosis hay incorporación de Timidina mayor que en el control.
2. No existen grandes diferencias en las cuentas por minuto entre las diferentes concentraciones.

CONCLUSIONES TRIPAN AZUL Y GIEMSA

1. A partir de 120.6 x 1010 moléculas x célula hay destrucción total de la membrana (Foto 1 Foto 1A).
2. Por debajo de esta concentración existe una acción parcial en la mayoría de las células y unas pocas células que es lo que corresponde a cromatina regada (Foto 2).
3. Con dosis de 20 microlitros se destruye entre el 10 al 26% de las células.
4. Con 10 Microlitros se observa desprendimiento parcial de la membrana citoplasmática (Foto 3).
5. Dosis superiores a 100 muestran una acción sobre la membrana y la cromatina consistente en una distribución irregular de esta última y las membranas presentan un agrupamiento en bloques pequeños y grandes que se caracterizan por no tener ningún tipo de coloración.
6. Cuando se comparan dosis fraccionadas se observa que no hay ninguna diferencia significativa al hacer el conteo al final del tratamiento.

FOTO 1. Coloración Tripan Azul, concentración de 500 microlitros de C (OH)2,
muestra destrucción total de las células.

FOTO 1A. Coloración GIEMSA, concentración de 500 microlitros de Ca(OH)2, destrucción total de las células.

FOTO 2. Fibroblastos BHK, coloración GIEMSA, concentración de 100 microlitros:
algunas células permanecen íntegras (las que se observan redondeadas) pero se observa una acción parcial
sobre la cromatina de otras células, cromatina dispersa.

FOTO 3. Fibroblastos BHK, coloración GIEMSA, concentración de 10 microlitros de Ca(OH)
se observan dos fibroblastos con desprendimiento parcial de la membrana citoplasmática
(Efecto de saponificación).

DISCUSIÓN

En la proliferación celular está implicado el aumento en el número de células con replicación obligatoria del DNA se deben utilizar más de una técnica para verificar que dicha proliferación si está ocurriendo, estas técncias incluyen conteo directo de células, incorporación de sustancias radioactivas y técnicas de citogenética, en nuestro estudio, se aplicaron las tres, y ninguna nos indicó una proliferación celular. En su lugar existe correlación en los datos obtenidos con las tres pruebas independientes.

Los estudios realizados empleando las técnicas de Citogenética con el colorante GIEMSA y el recuento de viabilidad de TRIPAN AZUL indican que hay una destrucción celular directamente proporcional a la cantidad de hidróxido de calcio adicionado.

Esto se deduce del hecho que a dosis inferiores a 100 microlitros más del 60% permanecieron viables cuando se miraron con TRIPAN AZUL; lo cual significa, que en el 40% para 100 microlitros y 80% en 10 microlitros, tienen íntegro su potencial de membrana e integridad bioquímica capaz de impedir el ingreso del TRIPAN AZUL

Es importante resaltar que a una dosis de 10 microlitros de hidróxido de calcio, se mantienen íntegras más del 80% de las células y que a pesar de esto, no existió, en ninguna de las pruebas, incorporación de Timidina Tritiada superior al control; por esto no se analizó si la Timidina Tritiada estaba en el citoplasma o se había incorporado al DNA.

El que no existan grandes diferencias en las cuentas por minuto registradas en las diferentes concentraciones del medicamento implica problablemente que las cuentas por minuto registradas obedecen a la timidina que ingresó al citopalsma o a la que quedó atrapada en las membranas celulares cuando fueron destruídas las células.

Si se analiza el comportamiento bioquímico del hidróxido de calcio, se deduce que el medicamento, al entrar en contacto con líquidos se desdobla en dos iones (Ca y OH) elevando el pH medio; además el ión hidróxilo interactúa con las membranas celulares modificándoles el pH, produciendo una alteración de los fosfolípidos de la bicapa lípida celular.

Dicha alteración implica una separación de los fosfolípidos de la membrana, que dá como resultado el retiro de esta de la célula; y los fragmentos de membrana se reagrupan en bloques (Foto 1 – 2).

Todo este proceso probablemente corresponde al fenómeno de saponificación. Este efecto se presenta en forma inmediata, una vez se adicionan concentraciones superiores a 100 microlitros en 100.000 células.

Lo anterior se corrobora porque en las dosis fraccionadas, el efecto fue acumulativo, dado que el porcentaje de células afectadas en el transcurso del tiempo fue progresivo hasta hacerse igual al efecto de una sola dosis. Si no fuera inmediato, existiría diferencias cuando se aplica una sola dosis cuando se aplican fraccionadas, pues en el de una sola dosis en 5 horas tiene tiempo para desencadenar efectos indirectos diferentes al de dosis fraccionadas.

FOTO A. Fibroblastos BHK coloración Tripan Azul controles negativos,
morfología íntegra, y membrana refrigente al colorante, sin Ca (OH)2

FOTO B. Fibroblastos BHK coloración GIEMSA, controles negativos, relación núcleo citoplasma normal,
fibroblasto central en forma fibroblastoide, el inferior y superior redondeado
pero estructuras íntegras, sin Ca (OH)2

Esto indica que la acción es indirecta y no desencadenada a a través de segundos mensajeros.

Por el cambio inmediato de pH, la cromatina de la célula se rompe de manera abrupta, razón por la cual, se evidencia una dispersión de la cromatina cuando se aplican concentraciones superiores a 100 microlitros de hidróxido de calcio. Dicha disgregación de la cromatina disminuye progresivamente, a medida que disminuyen las concentraciones del medicamento.

El menor número de moléculas afecta con menor intensidad los fosfolípidos de membrana lo cual explica el retiro parcial de la membrana en la dosis intermedia y no alteración de la cromatina. Lo anterior indica que la membrana celular al ser destruida induce a la muerte celular por alteración de sus equilibrio osmótico. La dispersión de la cromatina y el retiro de la membrana imposibilita cualquier efecto estimulador o mitogénico sobre la célula. Por lo anterior, podemos concluir que el hidróxido de calcio tiene un efecto citolítico directo por alteración total o parcial sobre la membrana citoplasmática.

Esta alteración de la célula explica el ingreso de Tripan Azul a la célula y el porcentaje de mortalidad cuando se examinó viabilidad celular con dicho colorante.

Sin embargo debe tenerse en cuenta que clínicamente el hidróxido de calcio es efectivo en el tratamiento de procesos inflamatorios a nivel pulpar y periapical, produciendo proliferación celular y reparación de los tejidos. En el presente trabajo demostramos que la acción de hidróxido de calcio es de lisis celular. La aparente contradicción se debe resolver investigando la acción de derivados del hidróxido de calcio que no sean líticos en contacto con los tejidos vivos y en su lugar promueven la proliferación celular.

INFERENCIA CIENTÍFICA:

Por los resultados contradictorios, la metodología empleada fue rigurosamente aplicada y todos los pasos se repitieron varias veces con el fin de estandarizar la técnica, por esto los resultados son confiables en un alto porcentaje. Si se aplican como parámetros clínicos los hallazgos del estudio van a ayudar a buscar alternativas de medicamentos que de alguna manera resuelvan patologías no bien establecidas como la reabsorción de los tejidos duros. Así mismo a partir de los resultados del presente trabajo se han establecido líneas de investigación encaminadas al estudio del comportamiento a nivel celular, análisis in vitro para evaluar citotoxicidad de los materiales utilizados en odontología y esto determinará mejores procesos de control de calidad de los mismos.

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