Construcción de una Genoteca de cDNA de Plasmodium Falciparum

Y Búsqueda Posterior del Gen de Calmodulina

Resumen

Se construyeron dos genotecas de cDNA usando el método de Gubler y Hoffman, la primera partiendo del mRNA del parásito P falciparum, la segunda a partir del RNA total. Ambas en estadio de trofozoítos maduros y esquizontes.

Asimismo, se enfatizó en la búsqueda por hibridización de clonos que tuvieran el gen de la calmodulina, proteína mediadora que sirve como receptor intracelular de calcio. Y regula una variedad de enzimas y posiblemente está relacionada con los procesos de invasión del eritrocito. Se buscaron otros genes de interés de las proteínas miosina y Amasa, también involucradas en el proceso de invasión del eritrocito por el parásito.

Los títulos de las genotecas de cDNA fueron 1,7 x 104 ufp/pg de DNA, a partir de mRNA y 3,4 x l04 ufp/pg de DNA a partir de RNA total. Los rendimientos de la síntesis de primera cadena de cDNA fueron entre 15 y 20% mayores a partir de RNA total que a partir de RNA mensajero (mRNA).

Se obtuvieron trece clonos que hibridizaron con una sonda de calmodulina, dos de la genoteca de cDNA a partir del mRNA. Y once a partir del RNA total del parásito.

También ocho clonos que hibridizaron con una sonda de miosina, uno de la genoteca de cDNA a partir del mRNA y siete a partir del RNA total del parásito. Y cinco clonos que hibridizaron con una sonda de ATPasa, una a partir de la genoteca de cDNA a partir del mRNA y cuatro a partir del RNA total.

Como alternativa para la construcción de genotecas de cDNA, se plantea la uúlización de RNA total como material de partida. Sin embargo, es necesario validar el método en éste y otros organismos.

Palabras clave:

Genoteca, malaria, cDNA

Rosalba González Peña*, María Orfa Rojas Rojas**, Moises Wassermann**

* Trabajo de grado presentado para optar el título de Químico.
Departamento de Química. Universidad Nacional de Colombia.
Enfermera, Fundación Santa Fe de Bogotá.
** Grupo de Bioquímica Instituto Nacional de Salud. Bogotá, Colombia.
E-mail: rgonz@tutopia.com

Abstract

Two cDNA libraries were constructed, using the method proposed by Gubler and Hoffman. For the first one, we started with a representative populítion of mRNA from the F! falapamm. The second one, starts from total RNA; for both libraries we infected erythrocytes with mature trophozoites and schizonts parasite. Emphasis was made in the search of clones by hybridization, containing the gene of calmodulin, which is a mediating protein that serves as intracellular receptor of calcium, regulates a variety of enzymes, and is probably related to the processes of erythrocyte invasion.

Besides, we looked for other genes of interest in myosin and Amase, proteins that are also involved in the process of erythrocyte invasion by the parasite.

The titles of the libraries of cDNA were 1,7 x lo4 upf/ pg of DNA from mRNA, and 3,4 x lo4 upf/pg of DNA from total RNA. The yields of the syntesis of the first strand of cDNA were between 15 and 20% greater from total RNA than from mRNA. Thirteen clones were obtained, which were hybridized with a probe of calmodulin; 2 were taken from the cDNA library from mRNA, and 11 from total RNA. Also 8 clones were hybridized with a probe of myosin, 1 from the cDNA library from mRNA. And 7 from total RNA; in addition 5 clones were hybridized with a probe of ATPase, 1 from the cDNA library from mRNA, and 4 from the total RNA.

Accordmg to the results, the construction of cDNA libraries from total RNA is proposed as an alternate method. It should be of interest to apply it to other organisms in order to test its validtty.

Key words: library, malaria, cDNA

Introducción

El propósito del presente trabajo fue la construcción de una genoteca de cDNA representativa de la mayor población de mensajeros del parásito Plasmodium falciparurn constituyéndose así en un instrumento valioso para la búsqueda, caracterización y expresión de genes del parásito.

Además esta genoteca ofrece la oportunidad de producir proteínas individuales, que son de difícil obtención por extracción directa del parásito.

Se construyeron dos genotecas de cDNA por el método de Gubler y Hoffman; para la primera genoteca se utilizó el RNA mensajero (mRNA) del parásito como material de partida. Para la segunda, se propuso una innovación que consistió en panir del RNA total (mRNA, tRNA y rRNA). Se usaron parásitos en estadio de trofozoítos mhduros y esquizontes. Y se compararon los resultados en cuanto a la eficiencia en la conversión de mRNA a cDNA-cs (cDNA complementario de cadena sencilla), eficiencia de clonación y la probabilidad de encontrar secuencias de interés.

Asimismo, se enfatizó en la búsqueda del gen de la calmodha. Además se buscaron otros genes de interés general en otros proyectos del grupo de Bioquímica del Instituto Nacional de Salud. Como el gen de la miosina, y el de la Amasa.

Marco Teórico

La malaria es una enfermedad causada por esporozoarios del orden de Eucoccida, famitia Plasmodüdae, género Plasmoditrm. Existen diferentes especies que infectan al hombre y diversos animales (P. vivax, P. falciparum, P. malarie y P. ovale).

Las dos especies que afectan el hombre son el P. vivax y el P. falcipartrm, de las cuales la especie de mayor virulencia. Y morbimortalidad la constituye el P. falapartrm. Esta característica y el hecho de que pueda cultivarse in vitro han sido determinantes para elegirlo como modelo de los estudios de investigación en Bioquímica.

Importancia de la calmodulina en parásitos de la malaria

Se ha observado que la calmodulina en el eritrocito regula entre otras funciones la bomba de calcio, manteniendo la concentración libre intracelular de este ion en niveles inferiores de 0,l pM.(‘)

Con respecto a la participación de la calmodulina en la interacción hospedero-patógeno, Scheibel y cols. han reportado que los niveles de calmodulina en eritrocitos infectados por el parásito de la malaria en forma de anillos, llegan hasta 17,8+1,1 ngpor lo6 células. Y en forma de esquizontes llegan hasta 23,3+2,7 ng, comparadas con las células normales (1 1,2I 1,5 ng por 1 O6 células).(‘)

A su vez se ha comprobado que los niveles de esta proteína en el eritrocito infectado son proporcionales a la edad del parásito. Localizándose en forma difusa en el citoplasma de los parásitos maduros (trofozoítos y esquizontes) y en el complejo apical del merozoito. Desarrollando funciones en el proceso de invasión del eritrocito por el parásito y en los procesos metabólicos y de crecimiento del mismo. Por lo anterior, se hace necesaria la profündización de los estudios genéticos, moleculares y bioquímicos que tienen que ver con la proteína calmodulina. Y particularmente en los diferentes estadios de infección del glóbulo rojo por el parásito.

Genotecas de cDNA

La información genética transportada por el DNA es usada como plantilla para la síntesis de proteínas, por medio de un intermediario, la molécula de RNA mensajero, mRNA, el cual transporta las instrucciones para la síntesis de proteínas. En las células eucarióticas este proceso ocurre fuera del núcleo, en el ribosoma. Cada polipéptido sintetizado corresponde a una molécula de mRNA. Una célula eucariótica típica tiene alrededor de 10.000 secuencias de mRNA. El P h moditm falciparum, tiene alrededor de 2000 a 5000 especies diferentes de mRNA.(2)

Una estrategia hacia el aislamiento de un gen eucariótico particular, consiste en sintetizar el DNA complementario (cDNA) correspondiente al mRNA de interés (clon de cDNA).

Una genoteca de cDNA o banco genético, debe representar la mayor población de mensajeros y es construida a partir del mRNA. Las secuencias de interés, pueden seridentificadas por hibridización con sondas de oligonucleótidos, sondas de anticuerpos o de cDNA o de mRNA. La metodología de construcción de la genoteca se describirá más adelante.

Vectores de clonación

Dado que un clono es una población grande de moléculas, bacterias o células idénticas que surgen de un ancestro común, se uuliza la clonación como un medio que permite la producción de un número grande de moléculas idénticas de DNA. En este caso copias de cDNA, que codifican para genes de la mayor parte de proteínas de un genoma, particularmente del P. falciparum.

Una vez lograda la clonación, un dono particular que codifique para un gen de interés, puede ser identificado, aislado y caracterizado. Dicho proceso comienza una vez sintetizado el cDNA de cadena doble, cDNA-cd, en donde se utiliza un vector de clonación como vehículo al cual se le inserta el cDNA, vector que posteriormente infecta una bacteria de una cepa seleccionada. Y permite la replicación del cDNA.; finalmente se hace la selección de los clonos llamados recombinantes.

En el presente trabajo se utilizó un vector fago Agti i , el c d favorece la expresión eficiente del DNA en el hospedero (bacterias, E. coli); con un rendimiento alrededor de 1O4 fagos x ng de DNA vector.

Material y  Métodos

Inicialmente se cultiva y se sincroniza el Plasmoditrm faicipamq con el ánimo de que todos los parásitos estén en el mismo estadio de madurez. A partir de esto se aisla el RNA total que contiene las tres poblaciones de RNA, es decir RNA ribosomal (rRNA), RNA de transferencia (tRNA) y RNA mensajero (mRNA).(3)

De allí se hace la separación de mRNA que tiene una cola poli A en su extremo 3′; por medio de una cromatografía de afinidad que tiene en su matriz un extremo oligo dT. de este modo, al pasar el mRNA por la columna el extremo poliadenilado del mRNA. Éste se une a la matriz, dejando salir el rRNA y el tRNA. Luego el mRNA se eluye de la columna por tratamientos fisicoquímicos. (Figura 1)

Una vez se tiene el mRNA, éste se utiliza como plantiila para la síntesis del cDNA de cadena senda, cDNA-cs; a partir de la enzima transcriptasa inversa del virus de mieloblastosis aviar. Se usa una cadena corta de olgo dT, la cual se anilla con la cola poltA del mRNA. Y sirve como iniciador de la síntesis del cDNA. Hasta aquí se obtiene un híbrido mRNA-cDNA, de donde el cDNA se separa del mRNA plantilla por desnaturalización en caliente.

Luego sobre la primera cadena de cDNA (cDNA-cs) se sintetiza la segunda cadena de cDNA (cDNA-cd), utilizando la enzima E. coli DNA polimerasa 1, usando el extremo 3′ de la primera cadena como iniciador. Se adicionan grupos metilo (-CHJ al cDNA para evitar que éste sea cortado en los sitios internos por las enzimas de restricción. Se utilizan enzimas de restricción para hacer muescas o cortes en los extremos de las secuencias de cDNA. Permitiendo así la adición de brazos o adaptadores, que facilitan su unión al DNA del vector de clonación seleccionado, el fago A g t l 1. (Figura 2)

Figura 1. Separación de mRNA poliA por cromatografía de afinidad

Al vector de clonación, se le coloca una cubierta o capside y cola proteica, este proceso se denomina empaquetamiento. Y constituye el equivalente a fabricar un virion infeccioso. Finalmente, con el virion infeccioso, se infectan bacterias E. coli competentes previamente seleccionadas.

Estas bacterias tienen la maquinaria genética y molecular capaz de multiplicar y expresar los insertos de cDNA del parásito.

A su vez estas bacterias poseen mutaciones que permiten diferenciar las bacterias que tienen DNA recombinante de las que no, las primeras dan origen a placas blancas o huecos en los sistemas de cultivo (denominadas unidades formadoras de placa, upf) y las segundas dan origen a colonias azules. En este punto, si la clonación resulta exitosa, se considera construda la genoteca de cDNA.

Posteriormente, se hace el rastreo por hbridización de las secuencias de interés, para el caso de los genes de calmodulina, miosina y ATPasa; sobre las placas de fago. De otro lado, para el caso de la segunda genoteca, el cDNA se sintetizó utilizando como planda el RNA total. Es decir, sin hacer la separación previa del mRNA.

Es de anotar que no se ha reportado ningún trabajo en donde se ensaye la transcripción inversa sobre la planda de RNA total en P. falciparum

Resultados y Discusión

1. Para la extracción y purificación del RNA total se partió de parásitos en estadio de trofozoítos maduros y esquizontes, dado que la síntesis de RNA total durante el ciclo asexual del Plasmodizrm falcipawm presenta las más altas tasas en esos estadios. (4)

Las células son lisadas con isotiocianato de guanidina, se solubhza el tejido y las proteínas pasan de su estado nativo a desnaturalizado.

Se usan detergentes no iónicos como el sarkosyl porque lisan la membrana plasmática, conduciendo a un ácido nucleico intacto.

Se hace homogenización de la mezcla para favorecer la separación de RNA en la ultracentrifugación el cual es separado del DNA y proteínas, en un cojín de cloruro de cesio, dada su mayor densidad con respecto al DNA.

En general este método permite la extracción de un RNA La mayor dificultad en la extracción del RNA es evitar la contaminación con RNAsa, enzima muy estable que no requiere cofactores para su función. Por lo tanto, se deben tratar las soluciones y los materiales con 0,1% (v/v) de dietilpirocarbonato, DPC, el cual inactiva las ribonucleasas por modificación covalente.(6)

La cuantificación de la cantidad de RNA obtenido, se hizo por espectrofotometría, dado que los ácidos nucleicos presentan absorción a 260 nm y las proteínas a 280 nm.

Para el RNA de Piasmodium la relación de absorbancias a 260 y 280 nm, es de 2,3.q,’) Esta relación se utilizó como parámetro que permitió evaluar parcialmente la calidad del RNA total extraído. En este trabajo se aislaron desde 265,4 hasta 780 pg de RNA total a partir de los parásitos.

2. La separación del mRNA se hizo mediante una cromatografia de afinidad en columnas de oligo-dT celulosa y sepharosa 4B-poli U.

Para el Plasmodizlm falciparum el 82% del RNA total es ribosomal, aproximadamente el 14% es tRNA y una proporción muy pequeña 2-5% es mñNA. Usualmente con la cromatografía de afinidad se recupera entre el 1-2% del RNA total como mensajero.(‘)Por esto, en este procedimiento, al igual que para la extracción del RNA total, fue crítica la eliminación y la prevención de la contaminación con RNAasas. Se utilizaron dos matrices, una de oligo dT; y otra de sepharosa 4B poli U, con esta última se obtuvieron los mejores rendimientos de extracción y por eiio se utilizó en lo sucesivo.

Figura 2. Método de Gubler y Hoffman

En general, la matriz de oligo dT, forma complejos dT-poli A con soluciones bufler de alta fuerza iónica, por lo tanto su capacidad de enlace depende de la concentración de la sal utilizada, además del tipo de catión de la sal, la presencia de detergentes y la fuente de la celuiosa.

La elución del mRNA se hizo con soluciones bufer de baja fuerza iónica lo que desestabiliza los pares de bases híbridos.

La ventaja del uso de esta matriz es que es resistente a nucleasas e hidrólisis alcaiina y su capacidad de enlace es mayor que la de la sepharosa 4B poli U.

Igualmente, no se requieren agentes desnaturalizantes o altas temperaturas para la elución de la muestra, sin embargo, en el primer experimento utilizando esta matriz, la elución del mRNA se hizo con solución buffer de elución a temperatura ambiente, para el segundo experimento se hizo con esta solución a 65°C con el fui de favorecer la separación de las cadenas de RNA pohA con el oligo dT de la matriz además de la disminución de la fuerza iónica aportada por la solución buffer de elución.

A pesar de que en la literatura hay referencia de que la elución no requiere agentes desnaturalizantes y/o altas temperaturas), se observó que el rendimiento aumentó tres veces con respecto al anterior.

Sin embargo, con el ánimo de comparar rendimientos, se realizó una cromatografía utilizando sepharosa 4B poliU. Se realizó un tercer experimento en el cual se obtuvo un rendimiento del 4%,superior al reportado en la literatura; para este experimento se hizo control electroforético sobre un gel de agarosa l%/TBE yno se evidenció presencia de RNA ribosomal. En lo sucesivo se utilizó esta matriz.

Tabla 1. Síntesis de primera y segunda cadena de cDNA

3. Síntesis y fraccionamiento del cDNA.

Se construyeron dos genotecas de cDNA, utilizando las recomendaciones del kit Promega(R),(9) una partiendo del mRNA poliA separado por cromatografía de afGdad y la otra partiendo directamente del RNA total.

Se compararon los resultados en cuanto a la eficiencia en el porcentaje de conversión de mRNA a cDNA-cs (DNA complementario de cadena sencilla), título final de la genoteca y las probabdidades de encontrar cada una de las secuencias de interés.

A pesar de que la literatura(“) reporta que la actividad de la transcnptasa inversa es parcialmente inhibida por la presencia del tRNA y el rRNA, al comparar entre sí, los porcentajes de conversión de mRNA a cDNA-cs, se observó que fue entre 15 y 20% mayor para el cDNA sintetizado a partir del RNA total, que cuando se partió del mñNA. (Tabla 1) De otro lado, la literatura reporta(9) que los rendimientos de las síntesis de la primera como de la segunda cadena de cDNA, con la utilización del método de Gubler y Hoffman, son 10-30% y del 50-200% respectivamente; los resultados experimentales muestran que la síntesis de la primera y de la segunda se ajustaron a los resultados teóricos esperados.

Figura 3. Síntesis de primera y segunda cadena de cDNA
Auto radiografia de electroforesis en 1 % AGE/TBE: 1. cDNA cd-RNA TOTAL P.falciparum 2, d N A CS-RNA TOTAL P. falciparum 3. cDNA cd-mRNA CONTROL 4.cüNA cs-mRNA CONTROL 5.cDNA cd-mRNA P. falciparum 6. cDNA cs-mRNA P. falciparum 7. DNA A Hind nS-dATP (29 x lo’ cpm).

Tabla 2. Títulos de genoteca de cDNA

4. Resultados electroforéticos de la síntesis de primera y segunda cadena de cDNA.

Al comparar los tamaños del CDNA a partir del m A , (Figura 3) se observó síntesis en un rango de 564-5900 pb para el cDNA de cadena sencdla, y de 564-4200 pb para el cDNA de cadena doble.

Para el caso del cDNA a partir de RNA total, el tamaño entre la primera y segunda cadena se conservó (rango de 564-23000 pb); sin embargo, al comparar la síntesis obtenida a partir de los dos materiales de partida, el rango fue más amplio en el caso del RNA total. Vale la pena anotar que estos resultados fueron reproducibles en tres experimentos realizados. Por otra parte, para el cDNA-mRNA control cs y cd, se evidenció una banda de 1,2 Kb, acorde con lo esperado.

También se observó una banda de bajo peso molecular (menor de 500 pb), en la cual la literatura reporta, que corresponde a un anillaje aberrante del iniciador- mRNA que influye directamente en la síntesis de cDNA más cortos.”

La ligación de adaptadores al cDNA de cadena doble, cDNA-cd, se hizo con base en las recomendaciones de Promega@, utilizando un exceso molar 5O veces la plan de cDNA. Con el ánimo de mejorar la eficiencia en la ligación de adaptadores se hizo previamente generación de extremos romos sobre la cadena de cDNA, aun cuando en esta ligación se requiere más concentración de DNA ligasa que cuando se parte de cDNAs con extremos cohesivos.

Ligación al vector y empaquetamiento.

Se obtuvieron los resultados consignados en la tabla 2. En las cajas donde se observaron menos de 50 placas claras no se consideró como representativo para calcular la eficiencia del empaquetamiento. Para calcular la cantidad de recombinantes y los títulos de las genotecas, se cuantificaron las placas claras y azules de cada caja sembrada para cada sistema; para el vector ligado sin inserto, se determinó el porcentaje de las placas claras con respecto a las azules, éste dió una proporción 50% de placas claras y 50% de placas azules.

A su vez se determinó el porcentaje de las placas azules y claras en los sistemas vector-cDNA RNA y vector-cDNA RNA total P. falciparum. Se observó que con respecto al control, hubo un incremento del 20% en el número de placas claras en ambos sistemas (70%), que se consideraron como posibles recombinantes. Con base en lo anterior, se calcularon los títulos de las genotecas, que fueron 1,7 x l04 ufp/ug DNA para la genoteca de cDNA-RNA total P falciparum y 3,4 x l04 ufp/pg DNA 7 para la genoteca de cDNA-RNA, total P. falciparzrm.

Comparando estos resultados con cálculos teóricos hechos para la construcción de una genoteca de cDNA de P. falcipamm se concluyó que las genotecas obtenidas eran representativas.

De lo anterior se desprende que para la genoteca de cDNA a partir de RNA total, se logró demostrar que al obviar la cromatografía de afinidad se evita la degradación y fraccionamiento del mRNA, se dispone de todo elrriRNA para la transcripción y por ende contribuye a la obtención de una genoteca de cDNA más representativa de los mRNAs del parásito.

Preparación de las sondas para el reconocimiento de las secuencias específicas. El inserto de calmodulina se purificó y se marcó con un isotopo radioa~tivo~~ S-dATP, éste se utilizó como sonda para hibridtzar, la cual tenía una acuvidad específica de 5,45 x lo8 cpm/pg DNA.” De las dos genotecas se seleccionaron 13 clonos positivos, dos de la genoteca a partir de cDNA de mRNA y 11 a partir de la genoteca de cDNA de RNA total. (Figuras 4 y 5) En la purificación del inserto de ATPasa, la purificación del DNA plasmídico se hizo a partir de un sistema comercial.

La sonda tenía una actividad específica de 5,6 x lo6 cpm/pg de DNA, la cual se usó para hibridizar los filtros réplica de las genotecas de cDNA.(“)

De esta hibridización se seleccionaron cinco clonos recombinantes, uno a partir de la genoteca de cDNA de mRNA y cuatro del RNA total. Para la búsqueda del gen de miosina, se utilizó una sonda a partir de 200 ng de inserto, marcada con un isótopo radioactivo, la cual dió una actividad específica de 5,6 x lo7 cpm/pg.(‘a Se hibridizó sobre los filtros réplica hechos de la genoteca representauva y se obtuvieron ocho clonos positivos, uno a partir de la genoteca de cDNA de mRNA y siete del RNA total.

Figura 4. Hibridización de los filtros replica de las genotecas cDNA-mRNA y cDNA-
RNA total de F? falciparum con la sonda de calmodulina. Actividad de la sonda: 5,45
x l08 cpm/pg de DNA

Conclusiones

• A partir del método de Gubler y Hoffman se construyeron dos genotecas representativas de cDNA de Plasmodium falcipuram, de los cuales los títulos fueron dos veces mayor para la genoteca de cDNA a partir del RNA total del parásito que la construída a partir del &A.

• Al obviar la cromatografía de afinidad para separar el mRNA se obtuvo mayor cantidad de transcritos; evaluado esto por un mayor renduniento en la síntesis de cDNA.

La eficiencia de la síntesis de la primera y segunda cadena de cDNA a partir del RNA total fue entre 15-20% mayor en comparación con el cDNA sintetizado a partir del mRNA de Plasmodium falciparum.

A pesar de que para la búsqueda de los diferentes genes de interés se trabajó con un número limitado de clonos, en general la genoteca de cDNA a partir de RNA total, tuvo un mayor potencial de representatividad y por ende mayores posibilidades de encontrar cada una de las secuencias particulares.

Las genotecas construídas constituyen un material de partida importante para estudios de expresión de los genes del parásito y de esta forma en la dilucidación de los mecanismos moleculares involucrados en el proceso de invasión del glóbulo rojo en los diferentes estadios. Lo cual, junto con es tudio s bioquímico s, contribuyen al desarrollo de estrategias para el control de la enfermedad.

Figura 5. Confirmación de clonos positivos con la sonda de calmodulina
A. CONTROL (+). 8,3 ng de znserio de CaJmodubna
B. CONTROL F). 100 ng de DNAhgo 2.
Se sembraron 2 pi de D N A de cada don, se hibndyo con una sonda 5,45 x lo8 pn/pg

Glosario

Clono: representa un gran número de células o moléculas idénticas que provienen de una misma célula o molécula ancestral.

Genoteca: llamada banco de genes, está constituida por un gran número de fragmentos de DNAclonados de un genoma entero.

Vector de clonación: es una molécula de DNA, la cual se replica autónomamente en una célula huésped, un vector es utilizado para insertar un DNA extraño y posterior- mente replicarlo, se usa con el propósito de amplificar el material genético o una proteína.

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