Inmunodetección en el Fraxinus Sinensis y Cecropia Sy

Los seis pacientes positivos a Fraxinus mostraron reconocimiento por IgE específica de bandas de proteínas en un rango de peso molecular de 108 a 14 kD. Para cada una de las muestras se observó un patrón de reconocimiento diferente, esquematizados en la Figura 2.

Las bandas más frecuentemente reconocidas fueron las de 95 y 64 kD de peso molecular, detectadas por IgE de cuatro de las seis muestras analizadas. No se observó algún grado de reconocimiento por IgE en el suero de los pacientes positivos a Cecropia sp.

Isoelectroenfoque

Para el extracto de F. chinensis se evidenciaron bandas de PI entre 7.5 y 3.7 (Figura 3).

IEF – inmunodetección

Las bandas reconocidas por IgE presente en el suero de los pacientes corresponden al rango de PI de 3.7 – 7.5. Cada una de las muestras mostró un comportamiento diferente en el número de bandas reconocidas (Figura 4). Las bandas principalmente reconocidas fueron las de 6.3 y 5.6 de PI, por cuatro de las muestras positivas.

Figura 2. Patrones de reconocimiento de las proteínas de F. sinensis por IgE presente en el suero de los pacientes positivos.

Línea 1: Patrones de PI
Línea 2: Extrato de F. sinensis

Figura 3. Distribución de las proteínas del extracto de F. chinensis según su PI.

Inhibición del RAST

Con el extracto de F. sinensis absorbido a la fase sólida, se comparó la inhibición de la reactividad de IgE con extractos de F. velutina, F. americana, F. pennsylvanica, F. latifolia y Olea europea como inhibidores de la fase fluida. El extracto de Olea europea mostró una parcial reactividad cruzada con el F. sinensis seguido por el F. latifolia. Los extractos de F. velutina, americana y pennsylvanica, contienen menor concentración de los alergenos relevantes de reacción cruzada con el F. sinensis (Tabla 3).

Figura 4. Número de muestras que reconocieron cada una de las bandas de proteínas del extracto de F. sinensis de acuerso a su PI.

Tabla 3. Inhibición de la unión de la IgE al extracto de F. sinensis (fase sólida) por diferentes extractos de Flaxinus y Olea europea utilizados en la fase fluida.

ExtractoConcentración 50% de Inhibición (µg/mL)Fraxinus velutina17.7Fraxinus americana5.6Fraxinus pennsylvánica3.1Fraxinus latifolia1.7Olea europea0.25

Discusión

Uno de los hallazgos más importantes en este trabajo, fue determinar que el polen del Fraxinus sinensis es un alergeno importante dentro de los 20 que más frecuentemente inducen una respuesta mediada por IgE, en pacientes con alergia respiratoria de la ciudad de Bogotá.

La reacción alérgica fue confirmada mediante el RAST en el cual se observó que cinco de las seis muestras reconocieron proteínas del extracto de F. sinensis por IgE específica (83.3%). La prueba negativa correspondió a un paciente con una cruz de positividad en la prueba dérmica, resultado que no se considera significativo para el diagnóstico de alergia a un determinado antígeno.

Con el sistema de electroforesis utilizado, se detectaron 14 bandas proteicas en el rango de peso molecular de 101 – 14 kD y 16 bandas de PI 7.5 – 3.7 que muestran actividad alergénica.

Las bandas más frecuentemente reconocidas por IgE presente en el suero de los pacientes fueron las de 95 y 64 kD y de PI 6.3 y 5.6 en ambos casos reconocidas por cuatro de las seis muestras estudiadas.

Con el número de muestras analizadas, no es posible establecer un alergograma ni afirmar si existen proteínas alergénicas mayores o menores.

Cuando se comparó la positividad por pruebas dérmicas de los pacientes al extracto de F. sinensis con el de Fraxinus americana, ampliamente utilizado por encontrarse disponible comercialmente, se encontró que sólo siete de los veinte pacientes positivos a F. sinensis fueron detectados por el extracto de F. americana y dieciocho de los positivos a F. americana no fueron reconocidos por el extracto de F. Sinensis.

Las pruebas de inhibición del RAST realizada con extractos de otras especies de Fraxinus que se encuentran ampliamente distribuidas en Norte América y la Olea europea, árbol de importancia en alergia en España, mostraron que el extracto de Olea contiene mayor concentración de los alergenos relevantes que los extractos de F. latifolia, F. pensilvánica, F. americana y F. velutina respectivamente.

La reactividad cruzada entre granos de polen de árboles de la familia Oleácea ha sido claramente demostrada en el área del Mediterráneo. En este trabajo se encontró un alto grado de respuesta cruzada entre los cuatro géneros de la familia Oleácea más importante en el Mediterráneo: Olea europea, Fraxinus excélsior, Ligustrum vulgare y Phillyrea angustifolia, aunque no existe una total identidad entre estos cuatro tipos de polen (31). Igualmente en Michigan, Norte América, se evidenció la reactividad cruzada entre árboles nativos de la localidad como Fraxinus americana, Ligustrum vulgare y Elaeagnus angustifolia con la Olea europaea (32).

Las bases moleculares de esta reactividad cruzada han sido descritas, encontrándose una proteína similar al alergeno mayor de la Olea (Ole e I) en los extractos de Fraxinus excélsior, Ligustrum vulgare y Syringa vulgaris muy comunes en el Norte de Europa y Norte América.

Corresponde a una proteína de peso molecular aproximado de 19 kd con una secuencia idéntica en los veinte aa aminoterminales los cuales corresponden a cerca del 10% de la proteína (33).

En la ciudad de Bogotá la única especie de Fraxinus es la sinensis. Se encuentran otros géneros de Oleácea como Ligustrum y Olea aunque su representación fenotípica no es importante. El polen de estos géneros no ha sido reportado en los estudios aerobiológicos en la atmósfera de la ciudad.

Es posible que los pacientes que respondieron al extracto de F. americana y no al de sinensis, fueron originalmente sensibilizados por alguna de las otras especies de Oleácea encontradas en la ciudad o que existe en la atmósfera algún otro polen con recuento significativo que comparta alergenos con F. americana.

Este trabajo nos permite concluir que el polen del F. sinensis representa un alergeno importante en la ciudad de Bogotá, dato de interés en el futuro estudio de pacientes alérgicos, por lo menos mientras el Urapán continúe siendo uno de los árboles con mayor representación fenotípica de la ciudad.

Es necesario incluirlo dentro de los extractos utilizados para realizar pruebas dérmicas de rutina ya que se demostró que algunos pacientes no responden al extracto de F. americana que es comúnmente utilizado por alergistas de la localidad.

Acerca de Cecropia, observamos que tiene capacidad alergénica demostrada por la positividad (2.9%) a las pruebas cutáneas. Sin embargo, no fue posible confirmar esta capacidad mediante pruebas in vitro.

El extracto utilizado contenía una concentración de proteínas suficiente para realizar los experimentos in vitro. Aún así se encontró solo una banda de aproximadamente 42 kD con una intensidad que no corresponde al total proteico del extracto.

Es posible, tal como se describe en la literatura para otros granos de polen (34), que el pigmento interfiera con la cuantificación de proteínas y por tanto, no sea óptima para la saturación de la fase sólida en el RAST y en la detección de bandas en el SDS-PAGE.

Como se describió en el marco teórico, los extractos crudos contienen mezclas complejas de otras macromoléculas además de las proteínas.

Por la dificultad de obtener el polen de Cecropia puro, el extracto fue preparado macerando la flor completa lo cual aumenta la cantidad de material vegetal diferente del polen que contribuya al contenido de sustancias que interfieran con las pruebas in vitro.

Otra posibilidad es que las proteínas alergénicas sean de muy alto o bajo peso molecular por lo cual no pueden ser observadas con el sistema utilizado en este trabajo, aunque no correspondería a lo reportado en la literatura con relación al peso molecular de las proteínas alergénicas (5-70 kD) (35).

Como se expresó en el trabajo, por ser Cecropia una planta nativa de países tropicales, en donde no se ha avanzado en este tipo de investigaciones, no existe en la literatura reportes de preparación de extractos y caracterización de proteínas alergénicas de Cecropia por lo cual no disponemos de metodología estandarizada diferente a la utilizada en este trabajo.

Teniendo en cuenta que el estudio fue realizado en pacientes de Bogotá y que no se encuentran plantas de Cecropia en esta altitud, sería importante realizar estudios en sitios de Colombia donde Cecropia tiene representación significativa, por lo cual podría tener importancia como alergeno.

Por ejemplo, en un estudio de aerobiología realizado durante cuatro meses en Quibdó (Chocó), se observó que el polen de Cecropia representa cerca del 90% del total de polen recolectado (datos no publicados, estudios de aerobiología Hospital Infantil).

Este es el primer estudio de caracterización de alergenos de polen en nuestro país.

Aunque los resultados obtenidos con Cecropia no son concluyentes y que faltaría obtener más muestras de pacientes positivos a F. sinensis para determinar sus proteínas alergénicas mayores, indica que es necesario continuar con los estudios de caracterización de alergenos propios de nuestra atmósfera, no sólo en la ciudad de Bogotá, sino en las principales ciudades del país ya que la gran variedad de climas y la riqueza de la flora colombiana amerita el conocimiento de las partículas atmosféricas locales para optimizar el diagnóstico y tratamiento de los pacientes y contribuir a solucionar el problema de la población alérgica colombiana.

Agradecimientos

Este trabajo fue realizado gracias al patrocinio del Instituto Colombiano para el Desarrollo de la Ciencia y la Tecnología Francisco José de Caldas. COLCIENCIAS.

Queremos agradecer al doctor Julio Alberto Latorre (Q.E.P.D.), por la amistad y ayuda incondicional brindada.

Al Laboratorio Especializado del Hospital Infantil Universitario “Lorencita Villegas de Santos”, donde se realizaron los primeros ensayos.

A la doctora Rosa Codina de la Unidad de Inmunología y Alergia de la Universidad del Sur de la Florida (Tampa-USA), quien nos enseñó los aspectos experimentales de este trabajo. A la doctora Elizabeth García, por su colaboración en la consecución de los pacientes.

Al doctor Ramiro Fonnegra de la Universidad de Antioquia, por la recolección del polen de Cecropia sp. A Adrianita Cuéllar, Martica Mesa y Huguito Díez, por la preparación, corrección e impresión del manuscrito. A Elizabeth Bello por hacer las pruebas dérmicas de alergia a los pacientes. Todas las personas y especialmente a los pacientes que colaboraron en la realización de este trabajo.

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