Análisis Inmunológico y Estructural de los Alergenos

Caracterización de los alérgenos

Luis Caraballo, M. D.
Instituto de Investigaciones Inmunológicas. Universidad de Cartagena, Cartagena, Colombia.

Numerosos laboratorios en todo el mundo se dedican al estudio de los alergenos y gran cantidad de estas substancias están siendo analizadas actualmente. No se sabe cuántos alérgenos existen, porque aparentemente cualquier producto biológico tiene potencial alergénico

en una población susceptible, siempre que se exponga en el tiempo y concentraciones apropiadas. Se han purificado cerca de 200 alérgenos y la lista crece rápidamente.

Aparte de motivos científicos, este desarrollo se debe al aumento progresivo que han tenido en los últimos años las enfermedades alérgicas.

Por otra parte, el avance de la inmunología y la biología molecular sustentan técnicamente el minucioso enfoque que hoy en día se dedica al estudio de los alérgenos, esas moléculas que,

por razones poco definidas, inducen la producción de IgE y síntomas clínicos de alergias. El objetivo de esta presentación es explicar

y discutir los procedimientos requeridos para lograr la caracterización inmunológica, estructural y funcional de los alérgenos.

El concepto de alérgeno tiende a variar

Inicialmente el término alérgeno se refería a lo que hoy llamamos? ¿fuentes de alérgenos?, es decir, los pólenes, ácaros, mohos, alimentos, etc. Después de establecerse que cada una de esas fuentes tiene varios componentes (moléculas) alergénicos, estos últimos fueron designados como alérgenos y con ese sentido los emplearemos en esta presentación.

Luego se demostró que diferentes fuentes de alérgenos comparten moléculas alergénicas. Explicándose así porqué una persona sensibilizada a una de las dos reaccionaba al contacto con la otra. A la cual no se había expuesto previamente, fenómeno conocido como reactividad cruzada.

¿La introducción del concepto de epitope, así como la demostración del carácter timo dependiente de la la respuesta IgE y su modulación por el sistema HLA, permitió entender que, en una molécula, regiones tan pequeñas como de seis amino ácidos, son capaces de unir IgE específica, y lo que es más importante, algunos de estos? epitopes alergénicos?, cuyo tamaño y conformación es variable, tienden a ser inmunodominantes.

Teóricamente, la respuesta IgE contra una molécula alergénica es la sumatoria de las respuestas específicas contra cada uno de sus epitopes alergénicos, las cuales varían en intensidad. Las personas sensibilizadas contra un epitope reaccionarán contra los alérgenos que posean dicho epitope, no importando su origen.

Lo anterior ayuda a entender mejor el fenómeno de reactividad cruzada; esta será más intensa en la medida en que los alérgenos compartan mayor número de epitopes o estén involucrados los más alergénicos.

Cómo se estudian los alérgenos?

El proceso de caracterización de un alérgeno comprende varias etapas que van desde confirmar su alergenicidad hasta definir su estructura y función, con el fin de explorar las posibilidades de eliminar la respuesta IgE que induce o modificar la ya existente.

Los enfoques y técnicas empleadas pueden variar, pero todas se sustentan en el desarrollo de la inmunología, la bioquímica y la biología molecular. A continuación, se enumeran los principales pasos en la caracterización de un alérgeno, los cuales no siempre se siguen en el orden aquí expuesto.

1. Demostración de la unión a la IgE

Siendo estrictos, la demostración de la alergenicidad de un producto biológico debería hacerse experimentalmente, demostrando la capacidad de la molécula (o la fuente de alérgeno) para inducir la respuesta IgE en las personas o animales, ya sea in vivo o in vitro. Sin embargo, lo que habitualmente se hace es asumir que esta es capaz de inducir dicha respuesta y evaluar la capacidad de unión del alérgeno a la IgE del suero de pacientes alérgicos. Para el caso del extracto alergénico, esto se hace con pruebas cutáneas, RAST o cualquiera de las variantes de ELISA. Si se desea definir la unión IgE a los componentes no purificados, entonces se utiliza el ¿immunobloting?

2. Importancia clínica y epidemiológica

El papel que juega un alérgeno como inductor de síntomas en la población, es decir, como productor de enfermedades alérgicas, muchas veces se sospecha por la historia clínica acumulada por los médicos, y usualmente se demuestra mediante dos enfoques.

El más directo emplea pruebas de provocación, entre las cuales estan la provocación bronquial, nasal, conjuntival oral, cutánea y la prueba de liberación de histamina por los basófilos.

Una manera indirecta es hacer estudios epidemiológicos, investigando así una relación causa efecto a nivel de población.

Estos estudios han pasado de simples descripciones de prevalencia de reacción IgE contra alérgenos entre los pacientes, a investigaciones rigurosas sobre el impacto clínico de los alérgenos en pacientes y controles.

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3. Purificación

Aislar un alérgeno de su fuente es un paso esencial para analizar sus propiedades físicas, químicas, inmunológicas y funcionales.

Actualmente el procedimiento más utilizado es clonar el gen del alérgeno en un vector y hacer que la proteína recombinante sea producida por bacterias, levaduras u otras células eucariotas.

Para esto se necesita construir bibliotecas (¿libraries?) de cDNA, en donde se almacenan los genes de las proteínas que la fuente de alérgenos utiliza.

La identificación de los alérgenos entre esa gran cantidad de proteínas se hace aprovechando la IgE específica de los sueros de pacientes alérgicos.

Otra opción para purificar alérgenos es separando los componentes del extracto natural, para lo cual se emplean variadas técnicas de cromatografía e inmunoquímica.

Aunque es más dispendioso que el anterior, este enfoque tiene la ventaja de que se aísla y purifica el alérgeno nativo, que conserva la mayoría de sus propiedades biológicas, lo que no siempre sucede con los recombinantes.

4. Secuencia de aminoácidos

Para esto se usan métodos químicos convencionales, actualmente bastante automatizados, que dan resultados confiables siempre que la proteína esté lo suficiente purificada.

Sin embargo, en el caso de proteínas grandes no es fácil obtener toda la secuencia por estos métodos y se acostumbra a secuenciar sólo el extremo N-terminal de la molécula.

Cuando se clona el gen del alérgeno, se puede predecir la secuencia de aminoácidos de la proteína, empleando el código genético.

Generalmente esto se confirma secuenciando químicamente el segmento N-terminal de la proteína recombinante.

De la secuencia de aminoácidos, se derivan muchas de las propiedades físico-químicas del alérgeno, pero es especialmente importante su comparación con las restantes proteínas descritas, para determinar homologías con la secuencia de otros alérgenos, lo que, a su vez, permite predecir aspectos relevantes como la reactividad cruzada y la función biológica.

5. Reactividad cruzada

La propiedad de una molécula alergénica de inducir la producción de anticuerpos IgE capaces de reaccionar contra otras tiene implicaciones clínicas muy importantes.

Teóricamente, el número y características de las reacciones alérgicas no podrá conocerse mientras no se determinen completamente las reacciones cruzadas entre los alérgenos.

Para esto se emplean estudios de correlación estadística y pruebas de inhibición de la unión a IgE entre diferentes moléculas. ¿De estas pruebas, las más populares son la inhibición del RAST y del? immunobloting?

El principio básico es el siguiente: si una molécula B es capaz de inhibir la unión de la IgE específica contra la molécula A, es porque comparte sitios de unión de IgE con la molécula A.

Por otra parte, el uso de anticuerpos monoclonales y clonas de células T también ha sido de mucha utilidad para estudiar este problema.

6. Identificación de epitopes

Con el fin de analizar en detalle la respuesta inmunológica contra los alérgenos, es muy conveniente disecar los componentes inmunogénicos de estos, ya sea a nivel celular (epitopes T) o humoral (epitopes B). Simplificando, puede decirse que los epitopes son las unidades mínimas reconocidas por los anticuerpos o los receptores de los linfocitos T.

Generalmente, para identificar y localizar epitopes (¿pitope mapping?) es necesario conocer la secuencia de aminoácidos, a partir de la cual se sintetizan pequeños péptidos que, superponiéndose parcialmente en sus extremos, equivalen a toda la secuencia del alérgeno. Observando la linfoproliferación inducida por esos péptidos o sus combinaciones, se pueden identificar los epitopes T.

De manera similar, estudiando la unión de esos péptidos a los anticuerpos (monoclonales o contenidos en el suero de pacientes) se detectan los epitopes B. Cuando los anticuerpos que se unen al epitope son del isotipo IgE, se denominan epitopes alergénicos.

7. Utilidad diagnóstica

La utilidad diagnóstica de un extracto alergénico, ya sea de polen, acaro, alimento, epitelio de gato, etc., se calcula por la correlación positiva entre las pruebas cutáneas o el RAST con dicho extracto y la sintomatología clínica.

La utilidad diagnóstica de una molécula alergénica se mide por su potencial para reemplazar al extracto total, ya sea por si solo o en compañía de otros alérgenos purificados del extracto.

Los alérgenos mayores son los que inducen la producción de IgE específica en más del 50% de los pacientes y son responsables de más del 10% de la actividad alergénica del extracto total. Un alérgeno contra el cual reaccione el 90% de los pacientes sería un buen candidato para reemplazar el extracto total.

Por lo anterior, actualmente se evalúa la prevalencia de positividad contra cada uno de los alérgenos purificados, en la perspectiva de que sirvan como reactivos diagnósticos, tanto para pruebas cutáneas como para pruebas in vitro.

8. Potencial terapeútico de la caracterización de los alérgenos

Desde el punto de vista médico, el objetivo principal de la caracterización de los alérgenos es su aplicación para el control de las enfermedades alérgicas.

Durante el presente siglo la inmunoterapia (¿hiposensibilización?) con extractos alergénicos se ha mantenido como la única opción terapéutica capaz de modificar el curso de las enfermedades alérgicas, especialmente la anafilaxia por picaduras de insectos y los problemas respiratorios provocados por Aero alérgenos.

Avances logrados en la caracterización de los alérgenos

Sin embargo, este tratamiento se podría mejorar en cuanto a riesgos y eficacia. Como consecuencia de los avances logrados en la caracterización de los alérgenos, para el próximo siglo se proyectan alternativas terapéuticas novedosas.

Estas van desde su modificación química o genética para disminuir la reactividad IgE hasta su administración conjunta con secuencias de nucleótidos inmunoestimuladoras de la respuesta Th1. También se contempla la posibilidad de profilaxis con vacunación temprana de la población genéticamente susceptible.

Teóricamente, el potencial terapéutico de los alérgenos purificados es grande, aunque su demostración mediante ensayos clínicos en animales y en humanos tomará todavía algún tiempo.

9. Determinación de la función biológica

La función que desempeña una molécula cuando está en su fuente natural pudiera estar relacionada con su potencial alergénico.

Sin embargo, esto ha podido demostrarse solo en algunos casos. La mayoría de los alérgenos son enzimas con funciones importantes en el metabolismo o en las defensas de las plantas o los animales de donde provienen.

Las pruebas empleadas para establecer la función biológica de un alérgeno dependen del tipo de proteína y su homología con las ya existentes.

Actualmente la determinación de la función biológica de los alérgenos es más que todo de interés científico y está muy relacionado con el estudio de la estructura de dichas moléculas.

10. Esctructuras secundaria y terciaria de la caracterización de los alérgenos

La estructura tridimensional de un alérgeno puede predecirse mediante programas de modelaje molecular que aprovechan su homología con moléculas estudiadas experimentalmente con anterioridad.

Sin embargo, para establecer con certeza la estructura nativa son necesarios los estudios de espectroscopia (con resonancia magnética nuclear o dicroísmo circular) y cristalografía mediante difracción de rayos X. Al definir la estructura, se pueden analizar mejor las regiones alergénicas e inmunogénicas, así como su relación con las regiones biológicamente activas.

Los cambios estructurales globales secundarios a la mutagénesis dirigida también se perciben mejor en estas condiciones.

Dado que estos procedimientos corresponden a disciplinas hasta el momento poco relacionadas con la alergología experimental, su aplicación ha sido escasa. A pesar del gran potencial informativo que ofrecen.

Sin embargo, los adelantos que se han obtenido en el análisis inmunológico y funcional de diversos alérgenos cuya estructura primaria está definida. Hacen pensar que en los próximos años se obtendrán muchos avances en esta importante etapa de la caracterización de los alérgenos.