Análisis Bioquímico, Antigénico y Alergénico de Extractos de Hemileia Vastatrix (Roya del café)

Los hongos Basidiomicetos son aeroalergenos todavía poco estudiados. El bacidiomiceto Hemileia vastatrix es conocido por causar la roya en las plantaciones del café. Este hongo produce abundantes esporas anemófilas que pueden alcanzar alturas superiores a mil metros sobre la tierra y propagarse por largas distancia en la atmósfera. Un estudio preliminar en Brasil, demostró que la inhalación de esas esporas puede sensibilizar a individuos que residen en zonas caficultoras. Con la finalidad de demostrar la presencia del IgE Específica a ese hongo y la posible relación con enfermedades respiratorias alérgicas, fueron realizadas pruebas cutáneas de lectura inmediata en 378 individuos, utilizando los extractos de Hemileia vastatrix. Los extractos fueron preparados con las esporas del hongo, utilizado líquido de Coca y tris HCL como solución extractora. Para las pruebas intradérmicas se utilizó extracto en concentración de 0,02 mg. de proteína por mL. Los individuos fueron divididos en cuatro grupos de acuerdo con la procedencia (regiones caficultoras y no caficultoras) y la aparición de síntomas alérgicos, y un grupo de 50 trabajadores rurales de haciendas cafeteras. Se observó que hubo un número significativamente mayor de pacientes sensibilizados en el grupo IV (atópicos de zona caficultoras). Por la técnica de Western blotting, fue detectada IgE Específica en 20 bandas proteicas de Hemileia vastatrix en el suero de individuos que presentaban pruebas positivas para ese hongo. Concluimos que ese basidiomiseto Hemileia vastatrix es capaz de sensibilizar al ser humano, induciendo síntesis de IgE Específica, y que hay mayor sensibilización en individuos atópicos residentes en regiones caficultoras.

Miguel Croce*1, Eliúde Rosa da Costa Manso1, 2, Walderez Gambale3, Fabio F. Morato Castro1, Enio Pasquali4, José Enrique Pereira Pinto2, Claudia Eugenia de Oliveira Andrade5, Jorge Kleber Chavasco6, Lilian Takayama7, Eloisa Bonfá7, Julio Croce1, Santiago López Ortega8**.

*Becario de la Fundación de Amparo a la Investigación del Estado de Sao Paulo (Fapesp).
1 Servicio de Alergia e Inmunología del Hospital de Clínicas de la Facultad de Medicina de la Universidad de Sao Paulo.
2 Facultad de Medicina de Itajuba – MG.
3 Laboratorio de Alergenos Fúngicos del Instituto de Ciencias Biomédicas II (ICBII) – USP.
4 Servicio de Neumología – Hosp. San Lucas Riveirao Preto – SP.
5 Clínica de Alergia e Inmunología Clínica Varginha – MG.
6 Escuela Federal de Odontología y Farmacia de Alfenas (Efoa), Alfenas – MG.
7 Laboratorio de Reumatología – Unidad de Inmunidad Humoral (LIM 17) de la Facultad de Medicina de la Universidad de Sao Paulo.
8** Alergólogo Inmunólogo de la Universidad de Sao Paulo, Brasil.

Introducción

En alergología el conocimiento de los alergenos ambientales es esencial para un diagnóstico etiológico. Dentro de los alergenos conocidos, los hongos son los que sufren mayor variabilidad de un ambiente para otro (1). Hasta recientemente, la mayoría de las especies de hongos conocidas como alergénicas, eran casi exclusivamente pertenecientes a la subdivisión Deuteromycotina (2). Los Basidiomicetos despertaron la atención de los investigadores solamente en la década de los 70 (3-4). A partir de esto, fue demostrada la existencia de alergia a varias especies de Basidiomicetos (5-11). Los Basidiomicetos comprenden, aproximadamente, 25.000 especies de hongos que incluyen los Hongos “orejas de Palo”, “Bolets” o “mush eooms”, “Blrackeet Fingi” y las Royas. Su característica principal es poseer una estructura cónica llamada Basidio, donde son formados los basaidioporos. La mayo-ría de las especies libera esporas en la atmósfera en forma estacional. Las Royas son parásitas vegetales exclusivamente, o sea, cada especie es exclusiva de una única especie vegetal. Sus esporas presentan formas morfológicas variadas, con un diámetro medio de 10 um. El basidiomiceto Hemileia vastatrix es el causante de la Roya del Café (12). Pertenece a la subdivisión Basidiomycotina, Familia Pucciniaceae, orden Uredinales (royas).

El Café (Coffea Arábica) es una planta originaria de la alta Etiopía (13). Los efectos estimulantes de la bebidas preparada con sus frutos fueron descubiertos por los Arabes. A partir del siglo XVII, los europeos difundieron largamente su cultura en las colonias orientales y posteriormente en América (fig. 1). El hongo Hemileia vastatrix también fue primeramente identificado en Etiopía, en el siglo XIX, y si-guió la misma ruta del Café, atacando grandes plantaciones y causando grandes daños (14) (fig. 2). En el Brasil, la Roya del Café fue detectada a partir de 1970.

El hongo parasita la hoja del café, produciendo manchas de color amarillo anaranjado en el envés de la misma. Una de las características de la Hemileia vastatrix es la de esporular en ciertas épocas entre los meses de mayo y octubre, en esos meses son liberadas grandes cantidades de las esporas (12). En las proximidades de las plantaciones de café afectadas por la Roya, se observa una alta concentración de esporas en suspensión en el aire (15).

El aumento de incidencia de crisis de asma y rinitis en los meses de invierno no ocurre solamente en las ciudades industrializadas, donde los niveles de polución y frío son algu- nos de los desencadenantes y agravantes de las crisis y del aumento de la mortalidad por enfermedades respiratorias (16). Las regiones del interior del país también presentan mayor incidencia de crisis de asma en el invierno y probablemente hay otros factores ambientales que contribuyen para esos hechos.

Difusion planta cafe

El primer relato sugiriendo la capacidad alergénica del hongo Hemileia vastatrix fue hecho por Gambade et al. (17). Los autores realizaron testes cutáneos con extracto de Hemileia vastatrix en 36 individuos asmáticos, procedentes de la ciudad Paulistana de Ribeirao Preto. Encontraron 3 individuos (8.3%) con reacción positiva. Los datos preliminares, demostrando la existencia de individuos sensibilizados, llevaron a la sospecha de que la inhalación de las esporas del hongos Hemileia vastatrix pudiera estar relacionada con el desencadenamiento de las crisis de asma. El hecho tendría importancia en las regiones productoras de café, principalmente en los individuos que presentan crisis durante los meses de invierno.

Diseminacion geográfica del hongo de la Roya

El primer objetivo del trabajo fue estandarizar el extracto del hongo Hemileia vastatrix adecuado para ser utilizado en Pruebas Cutáneas. Como se trata de un Hongo todavía desconocido en alergología, fue necesario realizar análisis de la composición bioquímica y proteica de los extractos obtenidos. El segundo objetivo fue determinar la incidencia de sensibilización al hongo Hemileia vastatrix en una pequeña muestra de la población brasilera. Con tal finalidad fueron realizados Pruebas Cutáneas en grupos de individuos residentes en regiones productoras de Café y compararlos con individuos procedentes de otras regiones. Finalmente, demos-trar in vitro la existencia de IgE Específica para Hemileia vastatrix. En el suero de individuos sensibilizados.

Casuística y métodos

Fueron estudiados uredosporas del hongo Hemileia vastatrix recolectados directamente de las hojas del cafeto (Coffea Arábica) contaminadas por el hongo. Fue empleado el método de raspado directo de las lesiones micóticas de la hoja utilizando una lámina metálica.

La preparación de los extractos fue realizada en la propor-ción 10% (peso antígeno versus volumen del líquido extractor) de acuerdo con el método citado por Mendes (18), utilizándose como sustancias extractoras el líquido de Coca, sin fenol, y o Tris – HCL 0,05 M (pH 8,0). Resumidamente, luego del lavado del material y secado en la estufa, la masa fúngica fue triturada, luego mezclada con el líquido extractor, permaneciendo en constante agitación durante siete días, a 4 grados centígrados luego centrifugación, y el sobrenadante sometido a diálisis contra agua destilada y carbonato de Amonio 0,1 M. Los extractos así obtenidos pasaron por pruebas bacteriológicas para asegurar su esterilidad.

Posteriormente, fueron analizados en cuanto su contenido de carbohidratos por los métodos de Scott & Melvin (19), de proteínas por el método de Lowry (20) y de lípidos por el método de Frings (21). El fraccionamiento y caracterización de las proteínas de los extractos brutos fueron realizados por electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) según el método descrito por Towbin (22), utilizando padrones de bajo peso molecular (Calibration Kids, LMW 14.000 – 94.000, Pharmacia Laboratories, Usppsala, Sweden).

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