Andrés Augusto Arias1, María Teresa Rugeles1, Juan Álvaro López1 y Pablo Javier Patiño1.
1Grupo Inmunodeficiencias Primarias, Facultad de Medicina, Universidad de Antioquia, Medellín
Correo electrónico: aarias@catios.udea.edu.co
Marco teórico
La destrucción de microorganismos fagocitados por los neutrófilos (PMN) mediante la generación de oxidantes microbicidas ocurre gracias a la acción del sistema NADPH oxidasa.
Este sistema se encuentra ubicado en la membrana de las células fagocíticas y cataliza la producción de anión superóxido (O2-). Este sistema está formado por cinco proteínas: gp91phox, p22phox, p47phox, p67phox y p40phox, y mutaciones en cuatro de estas proteínas (gp91phox, p22phox, p47phox, p67phox). Conducen a una inmunodeficiencia primaria conocida como Enfermedad Granulomatosa Crónica.
Objetivo
• Expresar el gen normal (wt) y mutado (m) de la proteína p67phox en forma recombinante en el sistema Baculovirus.
Materiales y métodos
Subclonación del gen de p67phox en plásmido donador pFastBac. Los primeros EcoRIp67phox-reverse y EcoRIp67phox-forward se utilizaron para amplificar el gen de p67phox mediante PCR a partir del vector pBphox67, posteriormente se subclonó en el plásmido donador pFastBac. Se transformaron células DH5a en platos de agar con ampicilina, se verificó la correcta inserción del inserto por endonucleasas de restricción y PCR.
Transposición. Células DH10Bac fueron utilizadas para ser transformadas con 1ng del vector pFastBac-p67phox recombinante. Se incubaron a 37°C/24horas en medio suplementado con 50 ug/ml de kanamicina, 7 ug/ml de gentamicina, 10 ug/ml de tetraciclina, 100 ug/ml de X-gal y 40 ug/ml de IPTG.
Aislamiento del bácmido recombinante. Las colonias blancas que contienen el bácmido recombinante se seleccionaron para el aislamiento del DNA bacmídico recombinante.
Transfección de células Sf9 con el bácmido recombinante. Células Sf9 y H5 fueron utilizadas para su transformación con el bácmido recombinante mediante la utilización de liposomas catiónicos.
Western blot. Anticuerpos monoclonales contra p67phox humana fue utilizado para confirmar la presencia de la proteína recombinante en los lisados de células sf9 y H5.
Resultados
- El gen de la proteína p67phox se subclonó satisfactoriamente en el plásmido donador pFastBac
- Se produjo en forma recombinante p67phox humana en el sistema baculovirus.
Conclusiones y perspectivas
La producción de la proteína recombinante p67phox en nuestro laboratorio abre el camino para desarrollar estudios moleculares de los fenómenos que ocurren en la activación del sistema NADPH oxidasa.
De esta manera esperamos obtener información acerca de algunos dominios importantes en las proteínas del sistema oxidasa, con el fin de construir un modelo donde se postulen las posibles interacciones, formas de regulación y activación de este sistema enzimático, que redunden en un futuro en la posibilidad de modular negativamente la producción de radicales del O2.
