Leucemia Mieloide Crónica: Métodos

MÉTODOS

Pacientes: Se obtuvieron 12 muestras provenientes de sangre periférica (2,5ml) de pacientes menores de doce años diagnosticados por primera vez con Leucemia mieloide (C92), se transportó cada muestra hasta el laboratorio de genética molecular humana de la Universidad del Valle, donde se realizo la extracción RNAm y la caracterización de la translocación, como se describe a continuación:

Obtención de buffy coat: Se adicionó a la muestra de sangre periférica Histopaque 1077(Sigma) en un tubo Falcon de 25 ml. El preparado se centrifugó a 400 x g durante 30 minutos a temperatura ambiente, obteniendo el anillo espumoso o buffy coat (19).

Extracción de RNAm: El pellet obtenido se mezcla con reactivo Trizol en una proporción de 0,25 ul de muestra con 0,75 ml de Trizol (19).

Obtención del DNAc: Con la primera cadena de DNAc a alta temperatura, que incrementa la especificidad aumentando la producción de DNAc de longitud total, generando un DNAc de 12,3 Kb, mediante el uso de SuperScriptTM II Reverse Transcriptase (versión diseñada con una reducida actividad de RNAasa H e incrementada estabilidad térmica); esta enzima se purifica desde E. coli y contiene el gen modificado “pol”, del virus Molony Murine Leukemia. En general, se obtuvieron concentraciones de 1 ng-5 ul de RNA total o 1-500 ng de RNAm, lo cual permitió ajustar las reacciones a volúmenes de 20 ul.

Caracterización de transcritos: Diez microlitros de cada muestra fueron analizados en gel de poliacrilamida al 2% con AgNO3. Los casos positivos para b2a2 mostraron una banda de 238 pb y para b3a2 la banda era de 313 pb (figura 1).

Controles: Se contó con el apoyo de 24 familias que mediante consentimiento informado facilitaron muestras provenientes de doce niños y doce niñas normales, como control negativo para el análisis de algún tipo de rearreglo BCR/ABL que expresara transcriptos p210 BCR-ABL.

RESULTADOS

Entre diciembre de 2011 y marzo de 2012 se diagnosticaron 12 pacientes con Leucemia (tabla 1), si el comportamiento observado se mantiene, al final del 2012 se esperarían 48 pacientes, a diferencia de la cifra reportada en el 2009 de 28 pacientes.

El transcrito observado con mayor frecuencia fue b2a2 (8/12)(tabla 1) el cual según estudios realizados por Rosas-Cabral y colaboradores en México3, tiene un conteo plaquetario menor que el observado por el transcrito b3a2, además este transcrito b3a2 está asociado a una mayor actividad de trombopoyetina por lo que la conducta biológica de la LMC es diferente. A diferencia de otros estudios a nivel mundial el transcrito b2a2 es el de menor ocurrencia (tabla 2).

Análisis estadístico: Se estudiaron 12 pacientes en total, 8(67%) mostraron el transcrito b2a2 y 4(33%) el transcrito b3a2. 7(58%) eran hombres y 5(42%) mujeres. 8(67%) estaban con menos de tres años, mientras que 4(33%) superaban los 4 años. 5(63%) del transcrito b2a2 fueron hombres y 3(37%) mujeres, con el transcrito b3a2 la distribución fue equitativa entre hombres y mujeres(2:2). El promedio de edad del grupo fue de 3.8 años, en hombres 4.28 años y para mujeres 3.2 años.

Se quiso establecer si existía algún tipo de asociación entre los transcritos, la edad, el género, así como comparar prevalencias en los diferentes estudios pero la similitud con significancia estadística fue en el estudio ecuatoriano. Para los análisis se empleo el programa STATA y de manera simplificada se obtuvieron los siguientes datos (tabla 2 y tabla 3). Aunque se obtuvieron valores de OR que mostraban algún grado de asociación los intervalos de confianza que contenían el 1, hacían de esta observación poco confiable, además el valor de “p” muy por encima de 0.05 no es significante estadísticamente. Dicho de otra manera, no hay evidencia suficiente para establecer que la edad o el sexo tienen algún tipo de efecto sobre el transcrito y en términos generales entre los estudios el de mayor semejanza fue el ecuatoriano con un valor de X2=19 (p<0.000). es posible que aquí los componentes genéticos y ambientales estén mucho más marcados por la cercanía geográfica y los orígenes ancestrales.

Prueba molecular cualitativa: El RNAm extraído de leucocitos de sangre periférica por el método delácido guanidin- tiocianato-fenol-cloroformo (26). El DNAc se obtuvo a partir de RNA por oligo-dT priming (GIBCO). El PCR para los transcritos b2a2 y b3a2 de BCR/ABL se consiguió de acuerdo con el siguiente ciclo térmico: 95 oC/1 min, 62 oC/1 min, 72 oC/1 min, previa desnaturalización a 96 oC/3 min y extendido a 72 oC/10 min. Se usaron “primers” sense y anti-sense y sus respectivos controles internos, al final 10 ul de cada muestra fueron analizados en un gel de agarosa al 2% y teñidos con bromuro de etidio. Dando positivo para b2a2 la banda más liviana (baja) y para b3a2 la más pesada (arriba) como se muestra a continuación en la figura 1.

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3 Alejandro Rosas Cabral, pertenece al Departamento de Biomedicina Molecular. CINVESTAV-IPN. México.