Leucemia Mieloide Crónica: Métodos

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MÉTODOS

Pacientes: Se obtuvieron 12 muestras provenientes de sangre periférica (2,5ml) de pacientes menores de doce años diagnosticados por primera vez con Leucemia mieloide (C92), se transportó cada muestra hasta el laboratorio de genética molecular humana de la Universidad del Valle, donde se realizo la extracción RNAm y la caracterización de la translocación, como se describe a continuación:

Obtención de buffy coat: Se adicionó a la muestra de sangre periférica Histopaque 1077(Sigma) en un tubo Falcon de 25 ml. El preparado se centrifugó a 400 x g durante 30 minutos a temperatura ambiente, obteniendo el anillo espumoso o buffy coat (19).

Encuesta sobre Vehículos en Colombia 🚘 🛣️

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Gracias por participar en esta encuesta. Su opinión es muy valiosa para conocer la percepción que tienen los consumidores sobre diferentes marcas de vehículos en Colombia. La encuesta es anónima y sus respuestas serán utilizadas únicamente con fines de investigación de mercado.

⏰ Duración estimada: 5 minutos.

Por favor, responda con sinceridad.

1. Ciudad de residencia*

Si no aparece su ciudad, por favor especifique cuál. 

1. Ciudad de residencia*

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2. Género   *

2. Género   *

3. Edad*

3. Edad*

4. Estrato socioeconómico (NSE)*

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5. ¿Cuál es la primera marca que viene a su mente cuando piensa en vehículos?

5. ¿Cuál es la primera marca que viene a su mente cuando piensa en vehículos?

6. ¿Qué otras marcas de vehículos vienen a su mente?

6. ¿Qué otras marcas de vehículos vienen a su mente?

7. ¿Qué otras marcas de vehículos (Camionetas, SUV, automóviles, pickups / camionetas de platón) vienen a su mente?

7. ¿Qué otras marcas de vehículos (Camionetas, SUV, automóviles, pickups / camionetas de platón) vienen a su mente?

8. De las siguientes marcas de vehículos, ¿cuáles recuerda haber visto o escuchado?*

8. De las siguientes marcas de vehículos, ¿cuáles recuerda haber visto o escuchado?*

9. ¿Qué tanto conoce cada una de estas marcas de vehículos?*

Por favor responda sobre cada marca.

9. ¿Qué tanto conoce cada una de estas marcas de vehículos?*

Por favor responda sobre cada marca.

Nada Conocido
Algo conocido
Muy conocido
Chery
Changan
Deepal
BYD
Geely
Great Wall
Jetour
MG
Zeekr

10. ¿De qué marca de vehículos recuerda haber visto, escuchado o leído publicidad recientemente?*

10. ¿De qué marca de vehículos recuerda haber visto, escuchado o leído publicidad recientemente?*

11. ¿De qué otras marcas de vehículos ha visto publicidad?

11. ¿De qué otras marcas de vehículos ha visto publicidad?

12. ¿En qué lugar o medio recuerda haber visto, leído o escuchado sobre estas marcas?

Chery - Changan - Deepal - BYD - Geely - Great Wall - Jetour - MG - Zeekr

12. ¿En qué lugar o medio recuerda haber visto, leído o escuchado sobre estas marcas?

Chery - Changan - Deepal - BYD - Geely - Great Wall - Jetour - MG - Zeekr

13. ¿Qué tanta publicidad ha visto de cada marca?*

Por favor responda sobre cada marca.

13. ¿Qué tanta publicidad ha visto de cada marca?*

Por favor responda sobre cada marca.

Nada
Poca
Mucha
Chery
Changan
Deepal
BYD
Geely
Great Wall
Jetour
MG
Zeekr
14. ¿Qué tan familiarizado(a) está con estas marcas?

Chery*

Chery*

Changan*

Changan*

Deepal*

Deepal*

BYD*

BYD*

Geely*

Geely*

Great Wall*

Great Wall*

Jetour*

Jetour*

MG*

MG*

Zeekr*

Zeekr*

15. ¿Qué palabras o atributos asocia con estas marcas?

Chery

Chery

Changan

Changan

Deepal

Deepal

BYD

BYD

Geely

Geely

Great Wall

Great Wall

Jetour

Jetour

MG 

MG 

Zeekr

Zeekr

16. ¿Cuál es su percepción general de estas marcas?*

16. ¿Cuál es su percepción general de estas marcas?*

Negativa
Neutral
Positiva
Chery
Changan
Deepal
BYD
Geely
Great Wall
Jetour
MG
Zeekr

17. ¿Ha comprado vehículos de estas marcas anteriormente?*

17. ¿Ha comprado vehículos de estas marcas anteriormente?*

No
Chery
Changan
Deepal
BYD
Geely
Great Wall
Jetour
MG
Zeekr

18. ¿Qué tan probable es que compre un vehículo de estas marcas en el futuro?*

18. ¿Qué tan probable es que compre un vehículo de estas marcas en el futuro?*

Muy improbable
Algo probable
Muy probable
Chery
Changan
Deepal
BYD
Geely
Great Wall
Jetour
MG
Zeekr

Extracción de RNAm: El pellet obtenido se mezcla con reactivo Trizol en una proporción de 0,25 ul de muestra con 0,75 ml de Trizol (19).

Obtención del DNAc: Con la primera cadena de DNAc a alta temperatura, que incrementa la especificidad aumentando la producción de DNAc de longitud total, generando un DNAc de 12,3 Kb, mediante el uso de SuperScriptTM II Reverse Transcriptase (versión diseñada con una reducida actividad de RNAasa H e incrementada estabilidad térmica); esta enzima se purifica desde E. coli y contiene el gen modificado “pol”, del virus Molony Murine Leukemia. En general, se obtuvieron concentraciones de 1 ng-5 ul de RNA total o 1-500 ng de RNAm, lo cual permitió ajustar las reacciones a volúmenes de 20 ul.

Caracterización de transcritos: Diez microlitros de cada muestra fueron analizados en gel de poliacrilamida al 2% con AgNO3. Los casos positivos para b2a2 mostraron una banda de 238 pb y para b3a2 la banda era de 313 pb (figura 1).

Controles: Se contó con el apoyo de 24 familias que mediante consentimiento informado facilitaron muestras provenientes de doce niños y doce niñas normales, como control negativo para el análisis de algún tipo de rearreglo BCR/ABL que expresara transcriptos p210 BCR-ABL.

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RESULTADOS

Entre diciembre de 2011 y marzo de 2012 se diagnosticaron 12 pacientes con Leucemia (tabla 1), si el comportamiento observado se mantiene, al final del 2012 se esperarían 48 pacientes, a diferencia de la cifra reportada en el 2009 de 28 pacientes.

El transcrito observado con mayor frecuencia fue b2a2 (8/12)(tabla 1) el cual según estudios realizados por Rosas-Cabral y colaboradores en México3, tiene un conteo plaquetario menor que el observado por el transcrito b3a2, además este transcrito b3a2 está asociado a una mayor actividad de trombopoyetina por lo que la conducta biológica de la LMC es diferente. A diferencia de otros estudios a nivel mundial el transcrito b2a2 es el de menor ocurrencia (tabla 2).

Pacientes pediátricos con Leucemia

Comparación de prevalencias en estudios mudiales

Relación entre algunas variables registradas y los transcritos

Análisis estadístico: Se estudiaron 12 pacientes en total, 8(67%) mostraron el transcrito b2a2 y 4(33%) el transcrito b3a2. 7(58%) eran hombres y 5(42%) mujeres. 8(67%) estaban con menos de tres años, mientras que 4(33%) superaban los 4 años. 5(63%) del transcrito b2a2 fueron hombres y 3(37%) mujeres, con el transcrito b3a2 la distribución fue equitativa entre hombres y mujeres(2:2). El promedio de edad del grupo fue de 3.8 años, en hombres 4.28 años y para mujeres 3.2 años.

Se quiso establecer si existía algún tipo de asociación entre los transcritos, la edad, el género, así como comparar prevalencias en los diferentes estudios pero la similitud con significancia estadística fue en el estudio ecuatoriano. Para los análisis se empleo el programa STATA y de manera simplificada se obtuvieron los siguientes datos (tabla 2 y tabla 3). Aunque se obtuvieron valores de OR que mostraban algún grado de asociación los intervalos de confianza que contenían el 1, hacían de esta observación poco confiable, además el valor de “p” muy por encima de 0.05 no es significante estadísticamente. Dicho de otra manera, no hay evidencia suficiente para establecer que la edad o el sexo tienen algún tipo de efecto sobre el transcrito y en términos generales entre los estudios el de mayor semejanza fue el ecuatoriano con un valor de X2=19 (p<0.000). es posible que aquí los componentes genéticos y ambientales estén mucho más marcados por la cercanía geográfica y los orígenes ancestrales.

Prueba molecular cualitativa: El RNAm extraído de leucocitos de sangre periférica por el método delácido guanidin- tiocianato-fenol-cloroformo (26). El DNAc se obtuvo a partir de RNA por oligo-dT priming (GIBCO). El PCR para los transcritos b2a2 y b3a2 de BCR/ABL se consiguió de acuerdo con el siguiente ciclo térmico: 95 oC/1 min, 62 oC/1 min, 72 oC/1 min, previa desnaturalización a 96 oC/3 min y extendido a 72 oC/10 min. Se usaron “primers” sense y anti-sense y sus respectivos controles internos, al final 10 ul de cada muestra fueron analizados en un gel de agarosa al 2% y teñidos con bromuro de etidio. Dando positivo para b2a2 la banda más liviana (baja) y para b3a2 la más pesada (arriba) como se muestra a continuación en la figura 1.

RNAm extraído de leucocitos


3 Alejandro Rosas Cabral, pertenece al Departamento de Biomedicina Molecular. CINVESTAV-IPN. México.

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Leucemia Mieloide Crónica: Métodos - Academia M. 099