Secuenciación de Nueva Generación (NGS) y Oncología de Precisión

Artículos Especiales

Gonzalo Recondo1.

Resumen

La secuenciación de nueva generación es una nueva herramienta de secuenciación masiva de ADN y ARN que ha cambiado radicalmente el diagnóstico molecular del cáncer.

Esta tecnología implementada de manera correcta permite seleccionar nuevos tratamientos dirigidos contra el cáncer con base en la detección de biomarcadores moleculares predictivos.

En este artículo revisaremos las aplicaciones de la secuenciación de nueva generación para el diagnóstico molecular del cáncer, el monitoreo de respuesta o resistencia, así como los nuevos fármacos que se encuentran disponibles o en desarrollo para alteraciones moleculares específicas, en pro de la promoción de la oncología de precisión.

Palabras clave: NGS; oncología; medicina de precisión.

Next Generation Sequencing (NGS) and Precision Oncology

Abstract

Next-generation sequencing is a new massive DNA and RNA sequencing tool that has radically changed cancer’s molecular diagnosis. This correctly implemented technology makes it possible to select new targeted treatments against cancer-based detection of predictive molecular biomarkers. This article will review the applications of next-generation sequencing for the molecular diagnosis of cancer, the monitoring of response or resistance, and the available new drugs or in development for specifi c molecular alterations to promote precision oncology.

Key words: NGS; oncology; precisión medicine.

Introducción

Por más de una década la secuenciación de nueva generación o NGS ha revolucionado el diagnóstico molecular del cáncer, abriendo nuevas oportunidades para el desarrollo de tratamientos innovadores y, como herramienta de estudio, ha permitido una mayor comprensión de la gran mayoría de los tipos de cáncer con proyectos como The Cancer Genome Atlas (TCGA) (1).

También la integralidad de los datos de NGS en plataformas de uso público como cBioportal y otras plataformas para clasificación de variantes y su accionabilidad como OncoKB, ClinVar y COSMIC ha facilitado el acceso a información ya curada y ordenada para la interpretación de datos (2).

NGS comprende diferentes tecnologías y técnicas entre las que se incluyen la secuenciación de pequeños fragmentos en paneles génicos, la secuenciación de ARN del exoma o genoma.

En este artículo nos referiremos a tecnologías de secuenciación de fragmentos cortos, tanto por métodos de secuenciación por síntesis como por ligación (3). En este proceso revisaremos las aplicaciones que tiene NGS en la oncología de precisión para el diagnóstico, monitoreo de sensibilidad y resistencia, así como las alteraciones moleculares más relevantes detectadas por NGS y las terapias dirigidas desarrolladas.

Aplicaciones de NGS en la oncología de precisión

La secuenciación de nueva generación ha impulsado el desarrollo de nuevos tratamientos con base en biomarcadores para múltiples tipos de tumores pediátricos y adultos.

Con el tiempo NGS se ha convertido en una herramienta de menor costo y mayor accesibilidad para los pacientes, gracias al desarrollo de plataformas centralizadas de testeos moleculares y al impulso de plataformas de secuenciación que se pueden realizar en el sitio de atención de los pacientes como hospitales académicos (3).

Utilizando bajas cantidades de ADN y ARN las diferentes plataformas de NGS permiten estudiar en simultáneo múltiples alteraciones moleculares que son potenciales blancos terapéuticos (4).

Esto ha sido de especial relevancia en el tratamiento del cáncer de pulmón no escamoso, en el que el desarrollo de la medicina de precisión ha evolucionado desde el entendimiento de las mutaciones activatrices de EGFR en el 2004 hasta la actualidad en la cual se encuentran en desarrollo fármacos para alrededor de una decena de alteraciones moleculares (5,6).

Adicionalmente, la secuenciación de nueva generación ha facilitado el desarrollo de tratamientos basados en alteraciones moleculares en colangiocarcinoma, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de ovario, mama, y biomarcadores llamados “tumor agnostic” o agnósticos que pueden estar presentes en diferentes tumores y son predictivos de respuesta a un tipo de fármacos.

La utilidad de la NGS tanto en tejido como en plasma es versátil, y con el solo fin de resumir algunas de sus aplicaciones hemos clasificado las instancias donde se presenta la oportunidad para estudios moleculares en cáncer en el diagnóstico, monitoreo de eficacia o progresión a tratamientos y detección de alteraciones que conllevan a resistencia a terapias dirigidas.

El estudio molecular en la práctica diaria es un hito fundamental para orientar el diagnóstico en algunos tumores como los del sistema nervioso central y sarcomas. Sin embargo, presenta una gran importancia como biomarcador para guiar el tratamiento de varios tumores. Muchos de los biomarcadores que se conocen han sido descubiertos utilizando técnicas de biología molecular de menor complejidad como pueden ser las mutaciones de EGFR, BRAF y KIT.

Hasta hace relativamente poco tiempo, el diagnóstico de mutaciones activadoras de EGFR en cáncer de pulmón se hacían mediante PCR y secuenciación Sanger, lo mismo que las mutaciones de BRAF V600X en melanoma.

Si bien ha sido considerado el gold standard, la sensibilidad de este método es baja, requiriendo que estas alteraciones estuvieran presentes en el 20% de las células tumorales en la muestra, siendo de crucial importancia la selección de la muestra (7).

Métodos más sensibles se desarrollaron luego como kits de PCR en tiempo real para detección de mutaciones puntuales e inserciones y deleciones (indels) con una sensibilidad del 5% (8). Otras alteraciones moleculares como fusiones de genes como ALK, ROS1, RET o NTRK pueden ser detectadas por otros métodos como la combinación de inmunohistoquímica (IHQ) e hibridación fluorescente in situ (FISH) dependiendo del caso (9).

Las alteraciones moleculares que conllevan a splicing alternativo patogénico del exón 14 del oncogén MET son más complejas de detectar por secuenciación sanger, y métodos como PCR de tiempo real (qPCR) son opciones no validadas para la identificación de pacientes que podrían beneficiarse de inhibidores selectivos de MET (10,11).

Adicionalmente, con el desarrollo de inhibidores selectivos de KRAS G12C, e inhibidores potentes de EGFR/HER2 en el contexto de inserciones en el exón 20, el espectro de blancos moleculares accionables se amplía a casi el 40% de los tumores no escamosos de pulmón.

La aplicación de NGS en el diagnóstico de cáncer de pulmón permite interrogar todos estos biomarcadores y otros con potenciales implicancias en un solo estudio y utilizando pequeñas cantidades de ADN.

Dado que todos estos biomarcadores son necesarios en el diagnóstico molecular de pacientes con cáncer de pulmón, realizar estas determinaciones por separado consume tiempo, tejido y es más costoso.

Un estudio realizado en Estados Unidos ha revelado que el uso de NGS permite ahorrar tiempo y costos en los centros centros que trabajan con Medicare o Medicaid y pagadores privados en ese país (12).

El beneficio de utilizar NGS y su impacto en la oncología de precisión no se traslada necesariamente a todos los tipos tumorales ni pacientes cuando se utiliza de manera global.

Varios estudios han demostrado que un pequeño subgrupo de pacientes se benefician de la secuenciación masiva sin selección clínica. En el estudio MOSCATO-01 del Instituto Gustave Roussy se incluyeron pacientes con cáncer avanzado que hubieran experimentado progresión de enfermedad al menos a una línea de tratamiento con biopsia suficiente para realizar NGS con panel multigénico, secuenciación de ARN (RNAseq) e hibridación genómica comparativa (aCGH) (13).

De manera similar, el estudio WINTHER exploró la utilización de NGS basado en ADN y ARN para la selección de tratamiento en pacientes con cáncer avanzado (14).

Se incluyeron 303 pacientes de los cuales 107 (35%) fueron evaluables para tratamiento. De los 107 pacientes, 69 (22% del total consentido) recibieron un tratamiento basado en resultados de NGS con ADN, y 38 pacientes (12,5%) recibieron tratamiento basado en selección por NGS en ARN.

Este estudio incluyo principalmente pacientes con tumores gastrointestinales, tumores de cabeza y cuello y cáncer de pulmón. La tasa de pacientes con enfermedad estable mayor a 6 meses fue del 26,2%, y 11,2% de los pacientes tratados experimentaron una respuesta parcial o completa. La mediana de sobrevida en los 107 pacientes fue de 5,9 meses (14).

Asimismo, el estudio multicéntrico I-PREDICT también evaluó la selección de tratamientos dirigidos basados en el perfil molecular de tumores de pacientes con diferentes tipos de cáncer, principalmente tumores gastrointestinales, ginecológicos y mamarios (15).

En este estudio se realizó NGS a partir de tejido, plasma y expresión tisular de PD-L1. De un total de 149 pacientes incluidos, con enfermedad avanzada y progresión a tratamiento estándar, 83 recibieron tratamiento y fueron incluidos en el análisis. De ellos, 73 pacientes recibieron una terapia personalizada de acuerdo con el perfil molecular del tumor, representando el 49% de los pacientes enrolados en el estudio.

Los tratamientos que fueron administrados incluyeron inmunoterapia, terapia dirigida contra la vía ERBB, la vía de las “mitogen- activated protein” (MAP) quinasas, vía de PI3K y otros (15). En el estudio I-PREDICT, el 30% de los pacientes presentó control de enfermedad mayor o igual a 6 meses. En aquellos pacientes cuyos tumores tienen mayor cantidad de alteraciones tratables la tasa de control de enfermedad fue, como era esperado, superior.

Estos estudios demuestran que hay un subgrupo de pacientes que presentan un beneficio con tratamientos dirigidos cuando se utiliza una estrategia basada en el perfilado molecular extensivo de diferentes tipo de cáncer.

Para estos pacientes, esto representa una oportunidad única de tratamiento, sin embargo, a nivel poblacional, la utilización de secuenciación de próxima generación en forma masiva impresiona tener un bajo impacto en beneficio en términos de supervivencia.

Si se orienta la utilización de secuenciación de próxima generación de acuerdo al tipo de patología y acceso a nuevas terapias, el impacto puede ser mayor.

Si se tiene en cuenta que, en pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas de histología no escamosa, la prevalencia de alteraciones moleculares con blancos terapéuticos aprobados o en vías de desarrollo alcanza el 40% de la población (16).

Y si bien la prevalencia de alteraciones moleculares varían de acuerdo a la población y el sitio geográfico, en occidente las mutaciones de EGFR ocurren en alrededor del 14% de los pacientes, las mutaciones de BRAF en el 1-2%, rearreglos de ALK en 3-7%, ROS1 y RET en alrededor del 2%, “skipping” del exón 14 de MET en el 4%, mutaciones de KRAS G12C en 9-11%, inserciones en el exón 20 de HER2 en el 2% y fusiones de NTRK en el 0.2% (16–18).

Para todas estas alteraciones moleculares hay drogas aprobadas o en vías de aprobación con actividad clínica demostrada en estudios de fase I/II, y la identificación de los mismos es necesaria para poder ofrecer terapias.

Hay otros tipos tumorales en los que la prevalencia de alteraciones moleculares es significativa y ameritan su estudio.

En cáncer de vejiga, las mutaciones de FGFR3 y fusiones de FGFR2 o FGFR3 ocurren en aproximadamente el 20% de los carcinomas uroteliales invasores, siendo reportado en 15% mutaciones de FGFR3 y en 6% fusiones, siendo las más frecuentes la fusión de FGFR3-TACC3 (19).

En colangiocarcinomas intrahepáticos, las fusiones de FGFR2 han sido reportadas en el 7% – 9%, las fusiones de ROS1 en el 8% y mutaciones de BRAF V500E en el 5%. Existen drogas con clara actividad clínica para pacientes cuyos tumores presentan estas alteraciones (20).

En cáncer de ovario las alteraciones en genes de la reparación homóloga como BRCA1 y BRCA2 ocurren de forma germinal en el 13-15% de las pacientes y en forma somática en el 7%, llevando a una alta proporción de pacientes que pueden recibir tratamientos con inhibidores de PARP (21). También en cáncer de tiroides anaplásico la prevalencia de mutaciones de BRAF alcanza el 40% (22).

En tumores papilares de tiroides también se reportan fusiones de RET (3%), NTRK (5%) y ALK (1%). En carcinoma endometriales, alrededor del 20-30% de los tumores presentan déficit de la reparación del ADN por la vía “missmatch repair” y en un 10% adicional presentan mutaciones en el gen de la polimerasa épsilon (POLE) que afecta la capacidad de corrección en la síntesis del ADN o función de “proofreading” (23).

También en ambos contextos, estos tumores presentan fenotipos “hipermutados” que los vuelven susceptibles a la muerte celular mediado por el sistema inmune cuando es estimulado con inhibidores de punto de control contra el eje PD-L1/PD-1.

Y En estos tumores y otros, en los que la prevalencia de alteraciones moleculares con potenciales implicancias terapéuticas es alta, el uso de la secuenciación de próxima generación se vuelve necesaria.

Adicionalmente a blancos moleculares específicos para cada tipo tumoral, existen otras alteraciones moleculares –que de estar presentes en cualquier tipo tumoral– son considerados blancos terapéuticos “agnósticos” o tejido inespecífico.

Las fusiones de NTRK, la inestabilidad microsatelital por déficit de “missmatch repair” y, más recientemente y controversialmente, la alta tasa mutacional o “tumor mutational burden” han emergido como biomarcadores universales, independiente del tipo tumoral.

La importancia de la aplicación de NGS en el diagnóstico molecular radica en el rol predictivo de alteraciones moleculares específicas para el tratamiento con terapias dirigidas.

También, los resultados obtenidos de estudios de NGS pueden dar información pronostica acerca de la biología tumoral y, en algunos casos, proveer información predictiva negativa para ciertos tratamientos, es decir que posiblemente el paciente no responda a una terapia determinada de acuerdo con el perfil molecular.

Otra de las aplicaciones que potencialmente tendrá NGS es en el monitoreo de la carga de enfermedad mediante la secuenciación de ADN tumoral circulante en plasma.

Esta no es una práctica estándar en la oncología al momento, sin embargo, la misma permite identificar mediante el monitoreo de las frecuencias alélicas de mutaciones somáticas tumorales el nivel de volumen de enfermedad, predecir respuesta o beneficio al tratamiento y recaídas previo a la evaluación mediante imágenes como la tomografía computarizada (24).

Este modelo ha sido imitado a lo ya establecido en el seguimiento de leucemias y otras enfermedades hematológicas y ha sido demostrado en patologías como cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de mama entre otros (25–27).

La tercer aplicación que tiene una visión más asociada a la investigación y el desarrollo de fármacos es el estudio de mecanismos de resistencia utilizando NGS.

De esta manera se han identificado múltiples alteraciones genómicas en genes que codifican proteínas que son blancos terapéuticos, impidiendo la unión del fármaco, o eluden la inhibición de señales intracelular, o generan resistencia a las inmunoterapias disponibles (28).

Existen en modo general tres grupos de mecanismos principales de resistencia a inhibidores de quinasas como blancos terapéuticos: la adquisición de mutaciones que impiden la unión del fármaco al blanco, o la amplificación del blanco, para lo cual la cantidad de droga es insuficiente para su inhibición; la activación de una vía de señalización intracelular paralela por mutaciones, amplificaciones o sobre expresión o sobre activación; y un tercer mecanismo menos conocido que implica modificaciones epigenéticas, alteraciones de la apoptosis o transformaciones histológicas (28).

El estudio sistemático de los mecanismos de resistencia mediante NGS es un desafío. En el estudio MATCH-R en curso en el Instituto Gustave Roussy de Francia, se busca identificar mecanismos de resistencia a una diversidad amplia de fármacos, incluyendo inhibidores de quinasas, inmunoterapia, inhibidores de ciclinas y hormonoterapia (29).

En pacientes que experimentaron una respuesta parcial o estabilidad de enfermedad mayor o igual a 6 meses, al momento de la progresión se toma una muestra tumoral y muestras de plasma.

La muestra de tumor es analizada mediante secuenciación con paneles a partir de ADN, secuenciación completa de ARN, secuenciación de exoma completo y también se deriva una porción de la biopsia para el desarrollo de modelos murinos.

De un total de 333 pacientes incluidos, 303 tenían material suficiente para la realización de al menos un estudio molecular (90%).

De estas muestras, se realizó NGS en el 92% de los casos, 72% secuenciación exomica completa y 71% secuenciación de ARN. Y de 127 pacientes tratados con una terapia blanco, a la resistencia se detectó una alteración molecular con potencial implicancias terapéuticas en 57 pacientes (45%) (29).

Más allá de este estudio que lo realiza en forma sistemática a través de distintos tipos tumorales, se ha generado una gran cantidad de evidencia acerca de los mecanismos genómicos de resistencia usando NGS que permitieron y aun permiten el desarrollo de nuevas drogas.

Alteraciones moleculares con implicancias terapéuticas detectables con NGS

Existen múltiples alteraciones moleculares que son biomarcadores de eficacia en los tratamientos actualmente aprobados o en desarrollo.

Las guías de la Sociedad Europea de Oncología Clínica (ESMO) sobre el uso de NGS recomiendan hacer este tipo de estudio en cáncer de pulmón no escamoso, cáncer de colon si no es posible por PCR, en colangiocarcinomas, cáncer de ovario y búsqueda de TMB para un subtipo de tumores (cuello uterino, glándulas salivares, tiroides, tumores y cáncer de vulva) (30).

Para todas estas enfermedades el panel de NGS debe incluir genes en la categoría I de “ESMO Scale for Clinical Actionability of molecular Targets” (ESCAT) (31). Las alteraciones categorizadas como “tier I” son blancos terapéuticos disponibles para diagnóstico de rutina con drogas disponibles y recomendadas para ser utilizadas con base en ese biomarcador.

Un resumen de todas las alteraciones moleculares clasificadas como Tier I se presentan en la Tabla 1. A continuación se detallan algunas características biológicas y tratamientos para las alteraciones moleculares más frecuentemente diagnosticadas con tecnología de NGS.

Genes y Alteraciones Moleculares

EGFR

El receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) es codificado por el gen ERBB1 y es un receptor de tirosina quinasa de la familia de receptores de factores epidérmicos como HER2, HER3 y HER4.

En condiciones fisiológicas, este receptor es activado mediante la unión de su ligando, el factor de crecimiento epidérmico (EGF), estimulando la homo- (EGFREGFR) o heterodimerización del receptor con otro receptor (ej: EGFR-HER3), resultando en la fosforilación de su dominio tirosina quinasa y la señalización intracelular mediante adaptadores que conllevan a la activación de múltiples vías como la de MAPK, PI3KCA/ AKT/mTOR, JAK/STAT entre otras (32).

El receptor de EGFR se encuentra involucrado en múltiples tipos de cáncer, desde glioblastomas hasta carcinomas colorectales en varias alteraciones que incluyen la sobre-expresión, la amplificación y las más comúnmente conocida en cáncer de pulmón, la mutación del dominio tirosina quinasa del receptor.

Las mutaciones del dominio tirosina quinasa de EGFR se encuentran comprendidas entre los exones 18-21 del mismo, siendo las “clásicamente” asociadas a sensibilidad con inhibidores de tirosina quinasa (ITQ) de EGFR caracterizadas en el año 2004 (33). Estas mutaciones son las deleciones en el exón 19 y la mutación puntual L858R en el exón 21.

Otras alteraciones moleculares comprendidas en los exones 18 y 20 como mutaciones puntuales consideradas infrecuentes activan la quinasa en forma constitutiva y son también pasibles de inhibición con ITQ de EGFR.

Se han desarrollados varios ITQ de EGFR siendo los de primera generación erlotinib y gefitinib, inhibidores de segunda generación afatinib y dacomitinib y el inhibidor de tercera generación osimertinib los que están comercialmente disponibles y aprobados en nuestra región (34).

En China, además se encuentra aprobado el Icotinib, que es un inhibidor de primera generación de EGFR (35). Los inhibidores de primera generación y afatinib tienen un espectro de actividad similar con tasas de respuesta que rondan entre el 62 y 84% de acuerdo al estudio, sobrevidas libre de progresión entre 8 y 13 meses y una sobrevida global de alrededor de 28 a 31 meses.

En estudios comparativos no se observaron diferencias en eficacia entre inhibidores de primera generación erlotinib y gefitinib (CTONG 0901) ni entre gefitinib y afatinib (LUX-LUNG 7)(36,37).

Dacomitinib, por el contrario, demostró mayor eficacia en términos de supervivencia libre de progresión y supervivencia global que gefitinib en el estudio ARCHER- 1050, 14,7 meses comparado a 9,2 meses (HR 0,59; P < 0,0001) y 34.1 meses versus 26,8 meses (HR 0,76; P = 0,0438), respectivamente (38). En aquellos pacientes que progresan a un inhibidor de primera o segunda generación, con detección en plasma o tejido de la mutación de resistencia T790M, son candidatos a recibir tratamiento con osimertinib, el inhibidor de tercera generación (39).

Recientemente, osimertinib pasó a ser un tratamiento estándar de primera línea basado en los resultados del estudio FLAURA que comparó osimertinib con inhibidores de primera generación erlotinib o gefitinib, demostrando mejoría en sobrevida libre de progresión y sobrevida global, 17,7 meses versus 9,7 meses (HR 0,45; P < 0,001) y 38,6 versus 31,8 meses (HR 0,79; P = 0,046) (40).

Las inserciones en el exón 20 de EGFR, también tienen un efecto oncogénico, resultando en una activación constitutiva del receptor por modificaciones estructurales que aumenta la afinidad de la quinasa por el ATP (41).

Sin embargo, estas últimas no son susceptibles a los inhibidores comercialmente disponibles en las dosis recomendadas. Nuevos inhibidores como poziotinib, mobosertinib (TAK-788) y el uso de osimertinib al doble de dosis (160 mg) tienen actividad en este grupo de pacientes, aunque suele ser de menor impacto que las mutaciones clásicas o de sensibilidad (42).

También se encuentran en desarrollo otras moléculas como Amivantamab, un anticuerpo monoclonal bi-específico MET-EGFR con resultados promisorios en este grupo de pacientes.

Asimismo, se encuentra en proceso de ampliación el uso de inhibidores de EGFR en estadios más precoces mostrando beneficio en termino de sobrevida libre de enfermedad en pacientes con cáncer de pulmón resecado EGFR mutados (43).

Si bien estas alteraciones moleculares pueden ser detectadas usando métodos que estudian solo EGFR como kits de PCR en tiempo real recomendados, el uso de NGS en este grupo de pacientes puede identificar otras alteraciones moleculares que pueden tener un rol pronóstico.

Por ejemplo la detección concomitante de mutaciones en los genes RB1 y TP53 se asocian con un mayor riesgo de transformación histológica a carcinoma de células pequeñas y con menor sobrevida libre de progresión (44). Lo mismo ha sido reportado con las mutaciones de TP53 y aquellos tumores con alta tasa mutaciones (TMB) (45).

También, con la mayor profundidad de secuenciación con NGS es posible detectar al diagnóstico tumores que presentan poblaciones subclonales con comutación de EGFR T790M previo al inicio de tratamiento en primera línea, permitiendo la selección de estos pacientes a tratamiento con osimertinib.

En el monitoreo de respuesta y resistencia a estas terapias, el uso de NGS cobra nueva relevancia.

La negativización de la detección de mutaciones de EGFR a los 3 y 6 meses de iniciado el tratamiento con inhibidores de EGFR en biopsia líquida ha sido asociada a mejor supervivencia (46).

Esto puede tener implicancias futuras en el diseño de estudios que utilicen intensificación de tratamientos en pacientes que no presentan caída de la frecuencia alélica utilizando combinaciones con quimioterapia o antiangiogénicos entre otros tratamientos.

En el estudio de la resistencia a osimertinib el uso de NGS probablemente tendrá un rol fundamental para seleccionar tratamientos subsecuentes.

La amplificación de MET es un evento que ocurre entre el 5% y 15% de los tumores a la progresión con esta droga, y combinaciones de inhibidores de MET y EGFR como savolitinib con osimertinib han demostrado eficacia clínica en el estudio TATTON (47).

Entre otras causas de resistencia que pueden ser identificadas con NGS están: mutaciones de resistencia como la EGFR C797S entre otras, fusiones de genes como ALK y RET entre otros, mutaciones de BRAF y otros oncogenes que activan vías de señalización paralelas a la inhibición de EGFR (48).

ALK

Los rearreglos o fusiones que involucran el dominio tirosina quinasa de ALK ocurren en 3%-7% de los adenocarcinomas de pulmón, y en alrededor del 50% tumores miofibroblástco inflamatorios pediátricos y del adulto.

También las fusiones de ALK han sido reportadas ocasionalmente en otros tipos de tumores como adenocarcinoma de colon, tumores de ovario, tiroides, cerebro (49). Mutaciones en el dominio tirosina quinasa de ALK son otro mecanismo de activación constitutiva de este receptor y han sido descripta solo en neuroblastomas pediátricos.

Al momento se han desarrollado clinicamente seis inhibidores de ALK, crizotinib un inhibidor de primera generación, ceritinib, alectinib, brigatinib y ensartinib de segunda generación y el inhibidor de tercera generación, lorlatinib.

El tratamiento con inhibidores de ALK es altamente efectivo, llevando la supervivencia de casi la mitad de los pacientes más allá de 4 años desde el diagnóstico de enfermedad metastásica (50).

El primer tratamiento instaurado para este tipo de tumores fue el uso de crizotinib, también inhibidor de ROS1 y MET, que demostró ser superior al tratamiento con quimioterapia. Gracias a la comprensión de los mecanismos biológicos de resistencia que desarrollaban las células tumorales como la mutación ALK L1196M o G1269A se desarrollaron inhibidores de segunda generación diseñados para unirse a la quinasa de ALK en presencia de estas mutaciones (51).

De allí, el tratamiento con ceritinib, alectinib y brigatinib en pacientes que presentan progresión de enfermedad con crizotinib conlleva a una tasa de respuesta entre el 40% y 56% y sobrevida libre de progresión entre 8 y 16 meses (34). El tratamiento con lorlatinib en pacientes que progresaron a crizotinib y un inhibidor de segunda generación sería la tercera línea de elección confiriendo tasas de respuesta del 40% y sobrevida libre de progresión de 6 meses (52).

Más recientemente, el abordaje de los pacientes con tumores ALK dependientes a cambiado, con la evidencia clínica que los inhibidores de segunda generación conllevan a una mayor sobrevida libre de progresión, mayor control y menor incidencia de metástasis cerebrales (53,54).

Lo mismo se observa con el tratamiento en primera línea con lorlatinib, con una franca reducción del riesgo de progresión sistémica y cerebral comparado con crizotinib (55).

El monitoreo de respuesta y resistencia a inhibidores de ALK usando NGS también fue estudiado por varios grupos de investigación, dando lugar al descubrimiento de diversos mecanismos de resistencia a inhibidores de ALK (56).

A diferencia de los inhibidores de EGFR, existen más de una decena de mutaciones de resistencia a ITQ de ALK con sensibilidad diferencial de acuerdo al tipo de mutación. Si bien el desarrollo de los inhibidores de ALK no requirió la selección molecular de las terapias con base en el perfil genómico del tumor a la resistencia, el conocimiento de los mismos puede dirigir mejor el tratamiento o estimar el potencial beneficio de una terapia.

Por ejemplo, en aquellos pacientes en cuyos tumores o plasma se detectaron mutaciones de resistencia de ALK, la tasa de respuesta con lorlatinib fue del 60% comparado con 30% en el grupo de pacientes en los que no se identificaron mutaciones de resistencia de ALK, lo que sugiere que lorlatinib es francamente más activo contra tumores que presentan mecanismos de resistencia ALK-dependientes (57).

La secuenciación de nueva generación también puede facilitar el entendimiento de la distribución alélica de mutaciones de resistencia cuando se encuentran dos o más mutaciones del dominio tirosina quinasa de ALK. Las mutaciones “compuestas” o en cis (presentes en el mismo alelo) son el principal mecanismo de resistencia a lorlatinib (58,59).

Se pueden identificar si las dos mutaciones se encuentran próximas en el mismo amplicon secuenciado. Esta identificación puede tener implicancias en el futuro ya que se encuentran en desarrollo fármacos específicos contra mutaciones compuestas determinadas.

ROS1

Las fusiones que involucran el dominio tirosina quinasa de ROS1 son menos frecuentes y rondan el 2% de los adenocarcinomas pulmonares (60). Como ALK, las fusiones de ROS1 han sido descriptas en otros tumores incluyendo colangiocarcinoma intrahepático, tumores del sistema nervioso central y sarcomas entre otros.

El diagnóstico clásico se realiza por tamizaje con inmunohistoquímica y confirmación con FISH.

El tratamiento de pacientes con cáncer de pulmón con fusión de ROS1 es con inhibidores de tirosina quinasa como crizotinib o entrectinib (61,62). En ambos casos, estos inhibidores confieren tasas de respuesta de alrededor del 72%-77% con supervivencia libre de progresión de 19 meses.

Ya se han descripto varias mutaciones de resistencia que pueden ser detectadas por NGS en tejido o plasma que causan resistencia a estos inhibidores, pero que son susceptibles a inhibidores de nueva generación como Repotrectinib o DS-6051b (63). Es posible que en el futuro cercano seleccionemos el tratamiento subsecuente conn base en estas mutaciones de resistencia, y el uso de NGS sea necesario para identificarlas.

BRAF

La mutación BRAF V600E, ya bien conocida por sus efectos en la biología tumoral del melanoma es también un blanco terapéutico en cáncer de pulmón, carcinoma anaplásico de tiroides, colangiocarcinomas, intrahepático y cáncer de colon.

Esta mutación permite la fosforilación de BRAF y su señalización como un monómero, independiente de la activación de efectores que activen la vía de señalización de MAPK (64).

Su identificación en diferentes tumores tiene implicancias terapéuticas, ya que se ha demostrado que el uso combinado de inhibidores de BRAF y MEK conllevan a tasas de respuesta significativas y control de enfermedad. Esto ha sido observado para la combinación de dabrafenib y trametinib en cáncer de pulmón, carcinomas anaplásico de tiroides y colangiocarcinomas (65–67).

También los inhibidores de BRAF/MEK combinados con anticuerpos monoclonales contra EGFR son una opción de tratamiento en carcinomas colorectales BRAF mutados. Hay kits aprobados de PCR en tiempo real para el diagnóstico específico de la mutación BRAF V600E.

Sin embargo, debido a que en el cáncer de pulmón y colangiocarcinomas por ejemplo hay biomarcadores a estudiar, el uso de NGS permite optimizar el material de biopsia para estudiar múltiples biomarcadores en simultáneo.

 La implementación de NGS en el estudio de resistencia a estos inhibidores también ha permitido identificar alteraciones moleculares en diversas vías como la vía de MAPK y PI3K/AKT/mTOR como principales causas de resistencia adquirida (ej: mutaciones de NRAS, PTEN, etc) (68).

Si bien esto no ha guiado el desarrollo de nuevas terapias al momento, permite comprender mejor como deberán desarrollarse las nuevas estrategias terapéuticas en el futuro.

RET

La activación oncogénica del receptor RET se da por dos vías principalmente, las fusiones del dominio de tirosina quinasa de RET o mutaciones puntuales (69). Los rearreglos de RET ocurren en el 5-10% de los carcinomas papilares de tiroides, en el 1-2% de los adenocarcinomas pulmonares, pero también han sido ocasionalmente detectados en cáncer de mama, colon, entre otros.

Las mutaciones germinales puntuales en el dominio extracelular (síndrome MEN2A) o en el dominio de tirosina quinasa (síndrome MEN2B) se asocian a la génesis de tumores hereditarios. Las mutaciones somáticas son detectadas en alrededor del 65% de los carcinomas medulares de tiroides esporádicos, siendo los más comunes el RET M918T, E768D y A883F.

Con el advenimiento de NGS, también se han detectado mutaciones de RET en feocromocitomas, paragangliomas, cáncer de mama, cáncer de colon y carcinoma de células de Merkel.

Existen varios inhibidores de tirosina quinasa no especificos de ret o también llamados “multiquinasa” utilizados en el tratamiento de los pacientes con cáncer de tiroides.

Sin embargo, recientemente, se han desarrollado inhibidores específicos de RET como el selperca tinib (LOXO-292) y el pralsetinib (BLU-667) (70,71). Ambos inhibidores selectivos de RET han sido aprobados por la FDA para el tratamiento de pacientes con cáncer de pulmón y rearreglos de RET.

La tasa de respuesta con estos inhibidores es de alrededor del 61% al 85%, dependiendo de si son dados en primera línea o luego de tratamiento con otros fármacos, con duraciones de respuesta prolongadas y actividad intracraneal.

NTRK

Los rearreglos de NTRK1, NTRK2 y NTRK3 pueden ocurrir con frecuencias muy disímiles en un extenso repertorio de tumores, siendo considerado un marcador agnóstico predictor de eficacia a inhibidores de tirosina quinasa de NTRK (72). Las fusiones de NTRK son casi patognomónicas en carcinoma secretorio mamario de adultos e infantes (92% de los casos) y en el fibrosarcoma juvenil (91-100% de los casos) y los tumores salivares MASC (90-100%).

Se encuentran también frecuentemente en tumores spitzoides (16%), nefroma congénito (83%); carcinomas de tiroides pediátricos (9-25%) y adultos (1,5-14%) y tumores del SNC pediátricos (10%). En tumores más prevalentes, las fusiones de NTRK son infrecuentes: cáncer de pulmón (0,2%), colon (1,5%), melanoma (0,3%), GIST (3,2%), colangiocarcinoma (3,2%), tumores de cerebro del adulto (0,4-3,1%).

Estas alteraciones pueden ser tamizadas con inmunohistoquímica en la mayor parte de los tejidos y confirmado por FISH. Sin embargo, el uso de NGS con paneles que detectan estas fusiones permite incorporar el estudio de las mismas en el marco del estudio de otros oncogenes.

El desarrollo de los inhibidores de NTRK de primera generación, larotrectinib y entrectinib, involucró un diverso grupo de pacientes con diferentes tipos tumorales (73,74).

Larotrectinib demostró unas tasas de respuesta en pacientes adultos y pediátricos del 81% con duraciones de respuestas prolongadas y buena tolerancia.

En pacientes adultos, la tasa de respuesta con entrectinib fue del 57,4% con sobrevida libre de progresión de 11,2 meses y sobrevida global de 20,9 meses. Interesantemente, debido al uso de NGS se han descubierto mutaciones de resistencia homólogas a otros genes similares como ALK y ROS1.

Ya se encuentran en desarrollo fármacos como el seletrecinib y el repotrectinib para poder sobrellevar la resistencia, inducidos por el tratamiento con inhibidores de primera generación (63,75,76). Por ello, el uso de NGS al diagnóstico y la resistencia serán de gran importancia para guiar el tratamiento de estos pacientes.

FGFR

El gen del receptor del factor de crecimiento fibroblástico (FGFR) se encuentra mutado en varios tumores siendo las mutaciones de FGFR3 las más frecuentes en carcinomas uroteliales, en los que puede estar presente en hasta el 20% de las muestras, especialmente de estirpe papilar y bajo grado (19). También se identifican fusiones de FGFR3 y FGFR2 en esta patología. Erdafitinib es un inhibidor de FGFR1-4 selectivo aprobado para esta indicación en pacientes con carcinoma urotelial avanzado y alteraciones de FGFR.

La tasa de respuesta con erdafitinib es del 40% y la sobrevida libre de progresión de 5,5 meses (77). Se estima que en otros 15 tumores se encuentran alteraciones de FGFR que podrían ser pasibles de tratamientos con este inhibidor, representando una prevalencia de este biomarcador en alrededor del 3,7% de los tumores (78). Pemigatinib también fue recientemente aprobado para el tratamiento de pacientes con colangiocarcinomas intrahepáticos que tienen fusiones de FGFR2.

La prevalencia de esta alteracion es de alrededor del 7-9% de los colangiocarcinomas, y el tratamiento con pemigatinib fue del 35% y la mediana de sobrevida libre de progresión fue de 6,5 meses (79). El estudio mediante NGS en plasma y tejido al momento de la progresión con inhibidores de FGFR ha identificado varias mutaciones de resistencia en el dominio tirosina quinasa (80).

Hay múltiples estudios evaluando el tratamiento con inhibidores de FGFR en distintos tipos tumorales (81).

MET

El oncogén MET participa del desarrollo y propagación de múltiples tipos diferentes de cáncer a través de varios mecanismos: el empalme patogénico o “skipping” del exón 14, mutaciones en el dominio de tirosina quinasa, la amplificación, la sobreexpresión y las fusiones que contienen el dominio tirosina quinasa de MET (82).

Salvo la sobreexpresión, los demás son mecanismos que ocurren a nivel genómico y son todos detectables utilizando secuenciación de próxima generación.

Las mutaciones o deleciones que afectan los sitios dadores y aceptores de empalme o “splicing” del exón 14 pueden ser detectados por NGS con paneles genómicos que comprendan toda la extensión del exón y sus intrones flanqueantes, permitiendo detectar las más de 100 variantes que dan como resultado un empalme patológico y pérdida del exón 14 (83). Esto es más fácilmente detectable utilizando NGS a partir de ARN como para la detección de fusiones.

Mediante el uso de ARN por secuenciación de nueva generación puede detectarse esta fusión intragénica entre los exones 13-15 que es el reflejo de la pérdida del exón 14.

El dominio juxtamembrana que es codificado parcialmente por exón 14 donde se contiene el residuo Y1003, que es clave para la unión de la proteína ubiquitinizadora CBL, participa en la degradación del receptor. Cuando se produce la pérdida del exón 14 y de este dominio yuxtamembrana del receptor, la vida media del mismo se prolonga, resultando en señalización oncogénica.

El skipping del exón 14 puede ser detectado por PCR real time también, sin embargo, este método no ha sido validado. El “skipping” del exón 14 de MET ocurre en alrededor del 4% de los pacientes con cáncer de pulmón, y es de suma importancia su detección ya que hay inhibidores selectivos de MET aprobados y en vías de aprobación para su uso en esta indicación como capmatinib y tepotinib (84).

Ambos fármacos han demostrado beneficio clínico para los pacientes, con tasas de respuesta que oscilan entre el 40 y 68% y sobrevida libre de progresión entre 5 y 9 meses de acuerdo con la línea de tratamiento en que fueron utilizados.

El uso de NGS a la progresión ha permitido identificar varios mecanismos de resistencia genómicos como mutaciones puntuales en el dominio tirosina quinasa (MET Y1230X, D1228X, L1195X) algunas siendo posibles de sobrellevar utilizando inhibidores de tipo II de MET como cabozantinib o merestinib (85).

También ha permitido identificar mecanismos de activación alternativa de vías de señalización como amplificación de EGFR, KRAS y mutaciones de KRAS que puede orientar el desarrollo de fármacos como inhibidores duales EGFR-MET.

Así, la amplificación de MET puede ser detectada mediante secuenciación de nueva generación, y en pacientes con cáncer de pulmón y amplificación de MET (definido como 10 o más copias de MET), datos iniciales con inhibidores selectivos han demostrado resultados promisorios.

Para tumores con mutaciones puntuales en el dominio tirosina quinasa de MET como los clásicamente descriptos carcinomas papilares renales, se encuentran en desarrollo tratamientos dirigidos, pero no son tratamientos estándar actualmente.

(Lea También: De las Imágenes, el Conocimiento Humano y Médico)

HER2

El oncogén ERBB2 codifica para la proteína HER2 que se encuentra amplificada en alrededor del 25% de los cánceres de mama, liderando el desarrollo de las terapias dirigidas contra HER2 en esa patología. La amplificación de HER2 es detectable por técnicas de inmunohistoquímica y FISH o ISH.

La amplificación de HER2 puede ser detectada en otros tumores como los adenocarcinomas gástricos, colangiocarcinomas intrahepáticos y adenocarcinomas de endometrio y cérvix.

En cáncer de pulmón, las inserciones o duplicaciones en el exón 20 conllevan a la activación constitutiva de este receptor en 1-2% de los pacientes (86). Ha habido muchos intentos de trasladar el beneficio de los anticuerpos monoclonales y anticuerpos conjugados como trastuzumab y TDM1 en el tratamiento de los pacientes con cáncer de pulmón e inserciones del exón 20 de HER2 (87).

Sin embargo, no se observó un beneficio clínico significativo con estos tratamientos.

Recientemente el desarrollo de trastuzumab deruxtecan (DS-8201) ha demostrado señales de actividad en ese grupo de pacientes con tasas de respuesta del 62% y sobrevida libre de progresión de 14 meses en este grupo de pacientes (88,89).

KRAS

KRAS es uno de los oncogenes más frecuentemente mutados en cáncer y sin embargo, hasta ahora no había sido posible desarrollar tratamiento específicos contra este blanco.

La mutación KRAS G12C, presente en 9-11% de los cánceres de pulmón no escamosos, de páncreas y colon, presenta una particularidad siendo que retiene capacidad de hidrólisis de GTP para pasar transitoriamente a una forma inactiva (90).

También en este contexto se forma un bolsillo críptico con la cisteína en el codón 12 que es pasible de inducir un bloqueo de la quinasa en estado inactivo (unido a GDP) mediante un nuevo grupo de inhibidores covalentes.

Fármacos como sotorasib (AMG 510) y adagrasib (MRTX-849) son inhibidores selectivos de KRAS G12C con tasas de respuesta del 32% y 45% respectivamente, reportados en la fase I/II de estos fármacos al momento (91,92).

Las mutaciones de KRAS no eran rutinariamente estudiadas en cáncer de pulmón, pero se ha modficado debido al desarrollo de estos fármacos y la disponibilidad de ensayos clínicos para los pacientes. Las mutaciones de KRAS también sirven como un biomarcador pronóstico negativo en cáncer de colon para el tratamiento con anticuerpos monoclonales contra EGFR. Estas mutaciones pueden también estudiarse por PCR real time utilizando kits validados.

Carga mutacional tumoral (TMB)

El valor de la carga tumoral es discutida en la práctica clínica como un biomarcador aislado de beneficio al tratamiento con inmunoterapia con inhibidores de punto de control del eje PD-1/PD-L1 y de CTLA-4. El TMB es el número de mutaciones somáticas en regiones codificantes, no sinónimas, por megabase de ADN. Trabajos iniciales en cáncer de pulmón utilizando secuenciación de exomas mostraban un beneficio en pacientes cuyos tumores presentaban un valor alto de TMB (93).

Sin embargo esto no se replicó de manera consistente en todos los escenarios, siendo un facor asociado a beneficio en algunos ensayos como el CheckMate-026 con nivolumab, el estudio MYSTIC con durvalumab, el estudio CheckMate 227 con ipilimumab y nivolumab y análisis post hoc del KEYNOTE 042 y 010 (94–96).

Sin embargo, esto no se ha replicado en otros estudios de combinación de inmunoterapia con inmunoterapia.

El estudio KEYNOTE-158 es un estudio de fase 2 de múltiples brazos que revisó el rol de pembrolizumab en pacientes cuyos tumores (10 tipos tumorales) tenían una tasa mutacional mayor o igual a 10 mutaciones por megabase, utilizando la plataforma de Foundation Medicine (97). La tasa de respuesta en el grupo de TMB alto fue del 29% (30/102), incluyendo respuestas en pacientes con cáncer de cuello uterino, endometrio, neuroendocrinos de bajo o moderado grado, tumores salivares, carcinoma de células pequeñas de pulmón, cáncer de tiroides y vulva. En pacientes con tumores anales, biliares y mesotelioma la tasa de respuesta fue mayor en tumores con TMB bajo. La FDA aprobó el uso de pembrolizumab en tumores con más de 10 mutaciones por megabase de TMB independiente del tipo de tumor, si bien solo estaban incluidos ciertos subtipos tumorales en el estudio.

Uno de los principales desafíos del TMB es la falta de armonización entre las diferentes plataformas.

Aunque se están llevando a cabo esfuerzos para hacerlo, aquellos paneles que no realizan secuenciación germinal en simultáneo con el tumor tienden a reportar valores de TMB más bajos que quienes filtran por variantes germinales (98) 297. Lo que sí es consistente a través de los diferentes estudios es la pobre correlacón entre el TMB y la expresión de PD-L1, lo que los convierten en biomarcadores independientes y complementarios a la hora de decidir tratamientos (99).

Desafíos para la implementación de NGS en Latinoamérica

Aun cuando todo lo anteriormente reportado denota un escenario ideal de acceso a secuenciación masiva y tratamientos innovadores, en nuestra región existen severas disparidades en el acceso a la atención oncológica, al diagnóstico histológico y tratamientos estándares (100).

Las tecnologías para la implementación de secuenciación de nueva generación no está ampliamente disponible en el continente, si bien hay equipamientos distribuidos en las grandes urbes que permiten este estudio. También se encuentran disponibles plataformas internacionales de secuenciación como Foundation Medicine, Caris y otras.

Sin embargo, el valor que tienen estos estudios puede rondar los USD$3.000 – USD$4.000, que constituyen un alto costo a pagar para la mayoría de los pacientes en países en vías de desarrollo como son la mayoría en nuestro continente.

También, la interpretación de estos resultados requiere del trabajo en equipo y el desarrollo de comités moleculares para poder evaluar la patogenicidad y accionabilidad de estas alteraciones moleculares y abocar o dirigir al paciente al mejor tratamiento disponible (101).

Conflictos de interés

El autor funge como consultor/asesor de Amgen, Pfizer, Roche.

Financiación de la investigación

Amgen. Becas de viaje: AstraZeneca, Pfizer.

Conclusiones

La secuenciación de nueva generación es una herramienta fundamental para el diagnóstico molecular moderno, permitiendo identificar en los tumores o plasma de las personas con cáncer alteraciones moleculares que permiten dirigir con precisión el tratamiento oncológico.

Esta implementación tecnológica debe ser hecha de manera accesible y en condiciones en las que el acceso de los pacientes a los medicamentos aprobados, a ensayo clínicos y a moléculas en uso compasivo sea posible.

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Recibido: Noviembre 24, 2020
Aceptado: Noviembre 24, 2020

Correspondencia:
Gonzalo Recondo
[email protected]


1 Gonzalo Recondo. MD PhD. Centro de Educación Médica e Investigaciones Clínicas (CEMIC), Buenos Aires, Argentina.

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