Artículo de Investigación: Detección de Helicobacter Pylori por PCR del Gen 16s

Biopsias gástricas colectadas en la ciudad de bogotá: Estudio preliminar

Sebastián Rojas-Lara1, Carlos Eduardo Barragán2, Martín Alonso Bayona-Rojas3
, Ricardo Oliveros4, Andrés Julián Gutiérrez-Escobar5 

Resumen

Helicobacter pylori es una bacteria relacionada con diferentes enfermedades digestivas que afecta a un número signifi cativo de individuos en la población Colombiana. Si bien se dispone de diferentes técnicas de diagnóstico para este patógeno, los procedimientos microbiológicos e histológicos utilizados rutinariamente requieren de varios días para generar resultados.

Actualmente las técnicas de biología molecular muestran resultados favorables para la identifi cación de patógenos debido a que cada vez son menos costosas y los resultados se obtienen en menor tiempo en comparación con los procedimientos convencionales.

En el presente estudio evaluamos la técnica de PCR de un fragmento del gen DNAr 16S para determinar la presencia de H. pylori en biopsias gástricas de pacientes que asistieron a consulta en dos Instituciones de salud en Bogotá. En 23 de 69 muestras evaluadas se identifi có la presencia de H. pylori. La metodología evaluada mostró ser pertinente y sencilla como protocolo de referencia para la detección rápida de este microorganismo en biopsias gástricas.

Palabras clave: Helicobacter pylori, biopsias, PCR, 16S.

Detection of helicobacter pylori by 16s rdna pcr in gastric biopsies collected in bogota: a preliminary study

Abstract

Helicobacter pylori is a bacterium related to different digestive diseases that affects a significant number of individuals in the Colombian population. Although it has different diagnostic tech niques for this pathogen, frequently used microbiological and histological procedures require several days to generate results.

Currently the techniques of molecular biology show favorable results for the identifi cation of pathogens because fewer costly and results are obtained in less time compared to conventional methods. In the present study we evaluated PCR of 16S rDNA gene fragment for the presence of H. pylori in gastric biopsies of patients attending consultation on two health institutions in Bogotá.

In 23 of 69 samples tested H. pylori was identifi ed. The methodology proved to be evaluated as a easy and relevant protocol for the fast detection of this organism in gastric biopsies. (Lea: Editorial: Incongruencias, El presidente, La ley estatutaria en salud, El plan nacional de desarrollo y El ministerio de salud)

Key words: Helicobacter pylori, biopsies, PCR, 16S.

Introducción

Helicobacter pylori es un bacilo Gram negativo fl agelado, microaerofi lo, con forma de espiral, que ha colonizado en forma natural a los seres humanos desde hace aproximadamente 10.000 años. La infección por H. pylori afecta aproximadamente al 50% de la población mundial, siendo así la infección más común del mundo (1,2).

En 1994 la Organización Mundial de la Salud (OMS) clasifi có a este patógeno como agente carcinógeno tipo 1 (3,4). Esta bacteria se ha asociado con diferentes enfermedades digestivas. Es conocida la implica- ción fi siopatológica de esta bacteria en la gastritis crónica activa. Además, es uno de los factores que intervienen en la etiología multifactorial de la úlcera péptica, el adenocarcinoma gástrico y el linfoma tipo MALT (Mucosa Linfoide Asociada a Tejido) de bajo grado de malignidad (5).

Se adquiere mayoritariamente en la infancia y presenta una baja frecuencia relativa (20 – 40%) en países desarrollados y una alta frecuencia (hasta 90%) en países en desarrollo (6,7).

En Colombia se ha investigado su presencia en muestras de biopsias gástricas y se ha esti- mado una prevalencia cercana al 70% (8). En un estudio que incluyó 203 pacientes, la prevalencia por H. pylori alcanzó un 94% (9).

El diagnóstico histopatológico más frecuente fue gastritis atrófi ca crónica en 36,4%. Sólo en el 1,4% de los casos, la mucosa gástrica era normal. La prevalencia de cáncer fue de 9,3% y la de úlcera gástrica 5,1%. El 96,9% de los tumores malignos fueron carcinomas y linfomas sólo 3,1% (10).

Un estudio realizado en Bogotá evidenció gas tritis crónica corporal en el 91% de los casos, de los cuales el 70% presentaban infección por esta bacteria (11). Un estudio mediante endoscopia a 1.022 participantes reportó que el 17,2% recibió diagnóstico de úlcera péptica, y de este grupo, un 92% presentó infección por este microorga1.022 participantes reportó que el 17,2% recibió nismo (12). ­

Para el diagnóstico de la infección por H. pylori se han desarrollado diversas pruebas invasivas y no invasivas que permiten establecer la presencia de esta bacteria en los pacientes. Actualmente pueden emplearse pruebas microbiológicas, serológicas y bioquímicas.

Sin embargo, son dispendiosas y de sensibilidad variable (13). Por este motivo la prueba de PCR para amplificar el gen ARNr16S de H. pylori ha despertado el interés en los últimos años (14,15).

La amplificación de segmentos del gen 16S mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) permite la detección de los genes codifi­cantes del ARNr 16S de bacterias, debido a que se encuentran altamente conservados en todos los microorganismos, los cuales tienen la particularidad de presentar variaciones concentradas en zonas específicas (14).

Las variaciones se encuentran en los oligonu­cleótidos firm11, secuencias específicas cortas que aparecen en la mayor parte de los miembros de un determinado grupo filogenético, y raramente están presentes en otros grupos, incluidos los más próxi­mos.

Por ello, estos oligonucleótidos firm pueden utilizarse para ubicar a cada bacteria dentro de su propio grupo, facilitando la identificación de especies (14). De igual manera, varios estudios demuestran la alta sensibilidad y especificidad de esta técnica para la identificación de H. pylori frente a las pruebas microbiológicas e histopatológicas (16).

El propósito del estudio fue identificar H. pylori mediante el empleo de la PCR de un segmento del gen 16S ARNr en ADN extraído a partir de biopsias gástricas de pacientes colombianos. Se contem­plaron las diferentes connotaciones clínicas como el diagnóstico endoscópico e histológico de las entidades patológicas con respecto a los resultados obtenidos por PCR.

Materiales y métodos

Criterios para la obtención de muestras. Los criterios endoscópicos fueron: mucosa enro­jecida con imágenes endoscópicas eritematosas compatible con gastritis, lesión tipo úlcera péptica compatible con úlcera, lesión tipo tumoral, coliflor o lisa, herniación de la mucosa sangrante o no sangrante compatible con cáncer gástrico. Cada caso tuvo un registro del diagnóstico endoscópico por parte del especialista.

Toma y trasporte de muestras. Se realizaron endoscopias de vías digestivas altas en consulta privada con el Gastroenterólogo, en dos institucio­nes de salud en Bogotá (Colombia), a pacientes quienes recibieron diagnóstico de gastritis, úlcera péptica, cáncer gástrico y mucosa sana durante el periodo de Noviembre 2012 a Diciembre 2012. Se empleó un equipo Olympus Evis Exera CLE- 145 Score, CV-145, y Endoscopio GIF Olympus Tips V, y las biopsias fueron tomadas con pinzas Olympus FB-21K.

Al cumplir con los criterios de inclusión-exclusión y de haber firmado el consentimiento informado y la autorización para la toma de la endoscopia, se procedió con la toma de biopsias según el pro­tocolo de Sídney del 2009 (17).

Se asistió a 117 procedimientos endoscópicos. En total 69 pacientes realizaron donación de biopsias gástricas. Los 48 pacientes restantes no autorizaron su participación o presentaron criterios de exclusión. La distribu­ción de las muestras por género fue: 36 hombres y 33 mujeres; el promedio de edad fue 56 años (17 y 83 años).

La procedencia correspondió a 49  pacientes de Bogotá y 20 pacientes procedentes de poblaciones aledañas.Se tomaron de una a siete biopsias en dos tubos con 15 ml de medio líquido Campylobacter con sangre de caballo al 7%, isovitalex al 2%, y antibióticos selectivos: trimetropin-sulfamatozazol al 0.1%, anfotericina al 0,1%, penicilina al y 0,1%, vancomicina 0,1%, en un tubo estéril de 15 ml y transportadas a 4° C a las instalaciones de la Universidad de Ciencias Aplicadas y Ambientales (UDCA) dentro de las primeras 6 horas (18).

Una vez en el laboratorio, las biopsias se homogenizaron vigorosamente en vórtex y se tomaron 150 μL del medio para las prueba de ureasa.

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1 Estudiante Medicina, Joven investigador, Grupo de Investigación en Ciencias Biomédicas y Genética Humana Aplicada GIBGA.
Universidad de Ciencias Aplicadas y Ambientales U.D.C.A., Bogotá.
2 Microbiólogo, M.Sc. Grupo de Investigación en Ciencias Biomédicas y Genética Humana Aplicada GIBGA. Universidad de Ciencias Aplicadas y Ambientales U.D.C.A.
3 Bacteriólogo, Esp., M.Sc. Grupo de Investigación en Ciencias Biomédicas y Genética Humana Aplicada GIBGA. Universidad de
Ciencias Aplicadas y Ambientales U.D.C.A.
4 Médico, Gastroenterólogo. Grupo de Investigación en Ciencias Biomédicas y Genética Humana Aplicada GIBGA. Universidad de
Ciencias Aplicadas y Ambientales U.D.C.A.
5 Lic. Biología, M.Sc. Líder Grupo de Investigación en Ciencias Biomédicas y Genética Humana Aplicada GIBGA. Universidad de
Ciencias Aplicadas y Ambientales U.D.C.A Bogotá, Colombia.