XIV Premio Aventis – Área de Ciencias Básicas y Experimentales Polimorfismo ß-2 Adrenérgico

Población Mestiza Colombiana y Respuestas de la Variante Alélica Gln27Glu al Propranolol

Dr. Carlos A. Isaza Mejía*, Dra. Julieta Henao**,
Dr. Eduardo Ramírez***, Dra. Fanny Cuesta****

* Médico Farmacólogo. Profesor Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad Tecnológica de Pereira (UTP).
** Médica Genetista. Profesora Facultad de Ciencias de la Salud UTP.
*** Médico Cardiólogo. Profesor Facultad de Ciencias de la Salud UTP.
**** Ingeniera Química, Farmacóloga. Profesora Facultad de Medicina de la Universidad de Antioquia.

Resumen

Los polimorfismos Arg16Gly, Gln27Glu y Thr164Ile del gen que codifica al adrenorreceptor ß-2 (ADRB2) se asocian con respuestas alteradas del sistema nervioso simpático.

El propósito de este estudio fue: a) determinar las frecuencias de las tres principales variantes alélicas del gen ADRB2 en una muestra de población mestiza colombiana y compararlas con las de otros grupos étnicos; b) puesto que el receptor ADRB2 regula la movilización de lípidos, evaluar si el polimorfismo Gln27Glu constituye un riesgo para el desarrollo de dislipidemia inducida por propranolol.

La genotipificación se realizó con técnicas de PCR-RFLP y se confirmó con secuenciación del DNA de muestras tomadas al azar. Para examinar la asociación entre el genotipo Gln27Glu del gen ADRB2 y dislipidemia secundaria al propranolol, se reclutaron 19 individuos sanos homocigotos para Gln27 (nativo, n=11) o para Glu27 (mutado, n=8). (Lea también: Polimorfismo ß-2 Adrenérgico, Resultados)

Las frecuencias alélicas son: Arg16 (69.7%), Gly16 (30.3%), Gln27 (68.8%), Glu27 (31.2%), Thr164 (99.3) e Ile164 (0.7%); los genotipos más frecuentes corresponden a las formas heterocigotas Gln27Glu (48.2%) y Arg16Gly (47.4%).

En la fenotipificación con propranolol encontramos que los homocigotos nativos Gln27 disminuyeron las HDL-C (p=0.005), mientras los mutados Glu27 incrementaron los niveles de triglicéridos (p=0.012), lo cual sugiere * Médico Farmacólogo. Profesor Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad Tecnológica de Pereira (UTP).

** Médica Genetista. Profesora Facultad de Ciencias de la Salud UTP. *** Médico Cardiólogo. Profesor Facultad de Ciencias de la Salud UTP.

**** Ingeniera Química, Farmacóloga. Profesora Facultad de Medicina de la Universidad de Antioquia. que el polimorfismo Gln27Glu, en sus formas homocigotas, representa un riesgo para dislipidemia inducida por propranolol.

Estos resultados pueden contribuir a un mejor entendimiento de los mecanismos fisiopatológicos de la dislipidemia secundaria a ß-bloqueadores y a racionalizar el uso del propranolol.

Palabras claves:

dislipidemia, farmacogenética, polimorfismo ADRB2, propranolol, receptor ß-2 adrenérgico.

Introducción

El receptor ß-2 adrenérgico, uno de los receptores del sistema nervioso simpático, media respuestas autonómicas fundamentales, tales como aumento del inotropismo y de la frecuencia cardíaca, relajación de músculos lisos (broncodilatación y vasodilatación), uteroinhibición, glucogenólisis con elevación de la glicemia, incremento en la secreción de insulina, lipólisis y degranulación de mastocitos. Dicho receptor constituye el blanco de un numeroso grupo de medicamentos agonistas y antagonistas adrenérgicos, ampliamente usados en la práctica clínica (1,2). El gen que codifica al adrenorreceptor ß-2 ha sido localizado en el brazo largo del cromosoma 5 (5q 31- 32), carece de intrones y consta de un bloque codificante de 1242 bp (GenBank: ADRB2, código de acceso M15169). El gen ADRB2 es polimórfico con varias sustituciones simples de bases (SNPs: single nucleotide polymorphisms), tres de las cuales son prevalentes en todos los grupos étnicos estudiados: A46G (cambia Arg16 por Gly), C79G (cambia Gln27 por Glu) y C491T (cambia Thr164 por Ile). Las frecuencias con que dichos alelos se distribuyen en la población varían entre los diferentes grupos étnicos, pero tales polimorfismos no han sido investigados en mestizo latinoamericano.

El SNP Gly16 es una variante con actividad de “downregulation” (“regulación a la baja”) aumentada, en comparación con el tipo nativo Arg16, de modo que cuando el receptor ß-2 es sometido a la acción de sustancias agonistas se pone en marcha el mecanismo de “downregulation” acentuado, con menor densidad de receptores ß-2 como consecuencia, lo cual se refleja clínicamente en una susceptibilidad aumentada a algunos trastornos y menor respuesta a medicamentos agonistas ß-2, comparado con el tipo nativo (Arg16) (3- 14). Por el contrario, el alelo Glu27 reduce la “downregulation” inducida por agonistas ß-2, lo cual le confiere resistencia a la desensibilización y respuesta incrementada a los agonistas ß-2, en relación con el tipo nativo Gln27 (4,7,10,15-17). Aún no está esclarecido el mecanismo de la “downregulation” alterada de estos dos polimorfismos, aunque los estudios indican que se modifica la degradación del receptor, después de su internalización (18,19).

Como puede verse, todas estas investigaciones se han enfocado en las relaciones existentes entre los polimorfismos mencionados y los medicamentos agonistas ß-2 y, aunque desde hace mucho tiempo se conocen las amplias diferencias interindividuales en las dosis útiles y en los efectos indeseables de los beta bloqueantes (1,20,21), aún no se ha investigado la relación que pudiera existir entre el polimorfismo del receptor ß-2 y los efectos deseables e indeseables de los fármacos que bloquean dicho receptor.

La dislipidemia representa uno de los efectos indeseables más intrigantes de los ß-bloqueadores, no sólo por lo que significa como factor de riesgo cardiovascular (22) sino porque todavía se desconoce el mecanismo que la induce y qué tipo de paciente está predispuesto a desarrollarla (1). Se sabe que las catecolaminas regulan la lipólisis en el tejido adiposo humano vía sus receptores a y ß. La estimulación a inhibe la lipólisis, mientras la estimulación ß incrementa la liberación de ácidos grasos libres en la circulación (1,23). Aunque algunos estudios muestran resultados discordantes (24), otras investigaciones han encontrado una fuerte asociación entre los polimorfismos genéticos del receptor ß-2 y trastornos metabólicos como hipertrigliceridemia, resistencia a la insulina y obesidad. Por ejemplo, se ha reportado que el índice de masa corporal (IMC) y los niveles séricos de triglicéridos están significativamente incrementados en individuos portadores del alelo Glu27 (7,15,22,25), mientras otro estudio mostró que los individuos homocigotos Gln27 ganaron más peso, más tejido graso subcutáneo y tuvieron mayor resistencia a la insulina cuando fueron sobre-alimentados, en comparación con los heterocigotos y los homocigotos Glu27 (26); el mismo alelo Gln27 parece asociarse con susceptibilidad incrementada a diabetes tipo 2 (27).

Por último, también se encontró aumento del fibrinógeno (28), así como incremento en los triglicéridos y disminución en las HDL-C en pacientes tratados con ß-bloqueantes (29,30). La causa de esta dislipidemia provocada por agentes bloqueadores ß no ha sido dilucidada, ni los efectos del polimorfismo ß-2 en las respuestas metabólicas a estos agentes han sido explorados. Este estudio fue emprendido con los siguientes objetivos: a) determinar la distribución alélica y genotípica de los polimorfismos Arg16Gly, Gln27Glu y Thr164Ile entre mestizos colombianos, y compararlas con las de otros grupos étnicos; b) determinar si existen diferencias en respuestas hemodinámicas y metabólicas al propranolol (bloqueante ß1 y ß2) entre homocigotos para el alelo nativo Gln27 y homocigotos para el alelo mutado Glu27.

Materiales y métodos

Sujetos. En la fase inicial de caracterización genotípica de los polimorfismos Gln27Glu y Thr164Ile participaron 141 voluntarios1 adultos de ambos sexos, no consanguíneos entre sí y de rasgos fenotípicos mestizos, en tanto que la genotipificación Arg16Gly se realizó en un subgrupo de 76 personas de la misma muestra, asegurando que los 19 individuos que participaron en la segunda fase del estudio fueran genotipificados para los tres polimorfismos estudiados. Cada voluntario firmó su correspondiente consentimiento informado. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética Médica de la Facultad de Ciencias de la Salud UTP, en la categoría de investigación con riesgo mínimo según la resolución No. 008430 de 1993 del Ministerio de Salud de Colombia.

Primera fase: genotipificación

Previa extracción del DNA genómico de leucocitos por el método que utiliza el kit GFX Genomic Blood Purification (Pharmacia Biotech), se procedió a la determinación de los alelos Gly16 y Gln27 de acuerdo con el procedimiento descrito por Aynacioglu et al. (31), con algunas modificaciones: los dos sitios de mutación (A46G y C79G) fueron identificados por análisis PCRRFLP. Las amplificaciones PCR del DNA genómico se realizaron en 50 ul de reacción, en presencia de 100- 200 ng de ADN, 0.2 mM de cada dNTP, 1X de buffer de reacción (50 mM de KCl y 20 mM de tris-HCl, pH 8.4), 1.5 mM de MgCl2, 1.0 U de Taq ADN polimerasa (Invitrogen, Life Technology), 10% de DMSO y 200 nM de cada “primer”, con las siguientes secuencias 5´-GAA CGG CAG CGC CTT CTT GCT GGC ACC CCA T y 5´-CTG CCA GGC CCA TGA CCA GAT CAG. Se amplificó un fragmento de 242 bp que incluye ambos sitios polimórficos. Para el alelo A46G las reacciones se incubaron por 3 min a 94oC, seguidas por 40 ciclos a 94oC por 45 s, 56oC por 30 s, 72oC por 45 s, con una extensión final a 72oC por 5 min; el producto amplificado fue digerido a 37oC por 2 h con 1.0 U de Sty I (New England Biolabs. Ins.).

Para el análisis del polimorfismo C79G el procedimiento fue similar y el producto amplificado fue digerido a 37oC por 2 h con 1.0 U de Fnu4H I (New England Biolabs. Ins.). Los fragmentos digeridos se separaron en gel de agarosa al 2% y se visualizaron y analizaron en lector de geles. Si la muestra es portadora de la mutación Gly16 se produce un patrón de fragmentos 214/28, y si es de tipo nativo da un fragmento de 242 bp; del mismo modo, si la muestra es portadora del alelu Glu27 se produce un patrón 236/6, y si es nativa el patrón será 181/55/6 bp.

Para el estudio del alelo Thr164Ile también se empleó el procedimiento PCR-RFLP propuesto por Aynacioglu et al. (31), que genera un fragmento de 280 bp con los primers 5´-GTG ATC GCA GTG GAT CGC TAC T y 5´-AGA CGA AGA CCA TGA TCA CCA G, en las mismas condiciones ya descritas, excepto que se emplean 58oC para el “annealing”. 10 ul del producto PCR se sometieron a digestión con 1.25 U de MnlI (New England Biolabs). Todos los fragmentos RFLP fueron separados en agarosa al 3% y visualizados por tinción con bromuro de etidio. Si la muestra es portadora de la mutación C491T se produce un patrón de fragmentos 230/50, y si es de tipo nativo da un fragmento de 116/114/50 bp. Con el propósito de confirmar resultados se hicieron secuenciaciones de muestras nativas y mutadas elegidas al azar, las cuales además se incluyeron como controles positivos. El procedimiento de secuenciación se realizó según el método didedoxi de Sanger, empleando el kit de secuenciación Thermosequenase Primer Cycle (Amersham Pharmacia Biotech), siguiendo las instrucciones del fabricante. La lectura de las secuencias nucleotídicas se hizo en el equipo secuenciador automatizado de DNA ALFexpress (software ALFWIN evaluation).

Segunda fase: expresión fenotípica (respuestas al propranolol)

Una vez concluida la tipificación del gen ADRB2 se pasó a la segunda fase que consistió en examinar la relación entre el tipo de respuesta al propranolol y la homocigosidad para el polimorfismo Gln27Glu del gen. Para ello se reclutaron 11 individuos homocigotos nativos (Gln27Gln) y 8 homocigotos mutados (Glu27Glu), clínicamente sanos, que no tuvieran antecedentes de asma o alergia al propranolol y que no hubieran consumido medicamentos por lo menos una semana antes de la prueba.

En un diseño doble ciego respecto al genotipo, los 19 voluntarios fueron sometidos a evaluación por el cardiólogo, con registro electrocardiográfico, frecuencia cardíaca (FC), presión arterial sistólica (PAS), presión arterial diastólica (PAD) e índice de masa corporal (IMC); si no existía impedimento a cada voluntario se le tomaba muestra de sangre para la medición de fibrinógeno, colesterol total (CT), colesterol HDL (HDLC) y triglicéridos (TG) y se le entregaban las tabletas de propranolol (Artensol ®, tab. de 40 mg, Lab. Ayerst- Hormona, Colombia) para que tomara 20 mg cada 12 horas durante 7 días.

A todo momento los participantes tuvieron la posibilidad de contactarse con los médicos tratantes para consultar posibles reacciones adversas y aclarar inquietudes, y se les recomendó que no modificaran su estilo de vida ni sus hábitos alimentarios durante la toma del fármaco. 3 a 4 horas después de la última dosis del séptimo día cada individuo fue nuevamente evaluado por el cardiólogo y se le midieron las mismas variables cardiovasculares (FC, PAS y PAD) en reposo e inmediatamente después de un régimen de ejercicio por 5 min en banda sinfin, similar al empleado por Zhou (21), que es una modificación al protocolo de Bruce: 1 min a 1.7 millas por hora (2.7 km/h) a 10º de inclinación, 1 min a 2.5 millas por hora (4 km/h) a 12º, 1 min a 3.4 millas por hora (5.4 kmh) a 14º, y 2 min a 4.5 millas por hora (7.2 km/h) a 16º. Nuevamente se tomaron muestras de sangre para la determinación de los niveles séricos post-tratamiento de CT, HDL-C, TG y fibrinógeno. En esta oportunidad también se tomó muestra de sangre en forma aleatoria a 10 participantes, a fin de determinar la concentración plasmática de propranolol, como prueba de control de cumplimiento de la prescripción y para efectos de comparabilidad entre los grupos.

Determinación de los niveles séricos de propranolol.

El procedimiento se apoyó en los métodos propuestos por Achari R et al (32) y Braza AJ et al (33). El propranolol (Sigma-Aldrich) en plasma fue medido en el equipo HPLC (Hewlett Packard modelo 1100, acoplado a detector de fluorescencia). A 1 ml de plasma se le agregaron 10 ml de diclorometano y 100 µl de agua. La mezcla fue agitada por 10 min y centrifugada luego a 2500 rpm por 15 min. La capa orgánica superior fue recolectada en 1 ml de KH2PO4 0.1 M (pH=2.8), agitada por 15 min y luego centrifugada otros 15 min a 2500 rpm. La capa acuosa (500 µl) fue entonces separada e inyectada en el HPLC (volumen = 100 µl).

Todos los reactivos fueron de grado analítico. Los solventes usados en la separación cromatográfica fueron de grado HPLC. El agua fue desionizada y filtrada en el sistema Mill-Q. La separación se realizó en una columna ciano propil de fase reversa (Supelco), conservando la columna a una temperatura constante de 40oC. La composición de la fase móvil fue acetonitrito: agua ácida 30:70 (trietilamina 1.2%, pH=3.0 con 85% de ácido fosfórico). El procedimiento se llevó a cabo a una velocidad de flujo de 1 ml/min durante 8 minutos, monitorizando el efluente en el detector de fluorescencia, con ondas de excitación y emisión de 315 y 350 nm, respectivamente. Bajo las condiciones arriba mencionadas el tiempo de retención del propranolol fue de 4.9 min. Los ensayos inter-día e intra-día para la estandarización de las curvas de propranolol en plasma (n=6) tuvieron un coeficiente de correlación mayor de 0.99, y el coeficiente de variación fue menor del 20% para todas las concentraciones. La recuperación de propranolol en plasma fue de 77.38%. Las curvas fueron lineales en un rango de 7.81 a 500 ng/ ml, por lo que consideramos el límite de cuantificación en 7.81 ng/ml para propranolol en plasma. Puesto que la codeína mostró mucha variabilidad, los resultados se estimaron sólo con estándar externo.

Perfil lipídico y fibrinógeno

El CT, las HDL-C, los triglicéridos y el fibrinógeno se determinaron por los métodos enzimáticos estándares.

Manejo estadístico

Todos los análisis se realizaron en el software SPSS 10.0 para Windows. Las frecuencias alélicas se calcularon con base en el número observado de cada alelo y en el número de cromosomas examinados por PCR-RFLP y secuenciación del ADN. El equilibrio de Hardy-Weinberg fue establecido mediante la prueba de Chi cuadrado. Las diferencias entre individuos homocigotos nativos y mutados se compararon con el test de Mann-Whitney; las diferencias intraindividuales (pre-tratamiento vs post-tratamiento) fueron comparadas con el test de Wilcoxon. Todas las pruebas estadísticas se hicieron de dos colas, y se consideraron significativos los valores de p < 0.05.