2.3 Formulación y Preparación de las Soluciones
2.3.1 Solución Amortiguadora
Ortofosfato disodico anhidro Na2HPO4 10 g
Ortofosfato monopotásico KH2PO4 5 g
Las sales se maceran y mezclan muy bien en un mortero, se disuelve un gramo de la mezcla en un litro de agua destilada. Las proporciones de sales anteriores dan buenos resultados tanto para preservación celular como para obtener los colores ideales en la coloración.
La prueba de idoneidad del agua amortiguadora está dada por el aspecto de las células sanguíneas, es decir, cuando se observan al microscopio después de la coloración (glóbulos blancos y principalmente las plaquetas). El pH final obtenido es aproximado a los 7.2. (Lea también: Recomendaciones para la Realización de Gota Gruesa y Extendido de Sangre Periférica en la Malaria)
2.3.2 Azul de Metileno Fosfatado
Cloruro de azul de metileno para microscopia 1 g
Ortofosfato disodico anhidro Na2HPO4 g
Ortofosfato monopotásico KH2PO4 1 g
Triturar muy bien los reactivos para lograr una mezcla homogénea. Pesar 0.8 g para disolver en 200 ml de agua destilada de buena calidad. De este stock se toma la alícuota de uso para una semana que corresponde a 50 ml, previamente filtrada, y se sirve en un frasco limpio, oscuro, boca ancha y tapa rosca.
La solución stock se puede conservar a 4°C; se debe tener en cuenta que antes de precolorear, el reactivo debe alcanzar la temperatura ambiente.
2.3.3 Solución A
Cloruro de azul de metileno para microscopia 0.8 g
Azur l o azur B para microscopia 0.5 g
Cuando no se tienen los anteriores reactivos, pueden ser reemplazados por 1,3 g de azur ll. Para disolver el colorante se utilizan 250 ml de agua amortiguadora pH 7.2.
2.3.4 Solución B
Eosina amarillenta hidrosoluble para microscopia 1 g
Disolver la eosina amarillenta en 250ml de agua amortiguadora pH 7.2.
Las soluciones A y B se almacenan en frascos ámbar. Para el uso diario se recomienda que sean alticuotas en frascos goteros de plástico que impidan el paso de la luz, los cuales deben dispersar gotas del mismo tamaño. Cada vez que se realice una coloración los frascos se cierran muy bien para evitar que haya contaminación de los colorantes.
Las soluciones se pueden almacenar a 4oC, sin que sus componentes se precipiten.
Cuando sea necesario, se debe realizar filtración de estas dos soluciones, en recipientes limpios en caso de observar contaminación y precipitado.
2.4 Procedimiento de Coloración para Gota Gruesa
La coloración para gota gruesa consta de dos pasos: precoloración y coloración.
2.4.1 Precoloración
Este proceso ayuda a preservar las células sanguíneas e iniciar el proceso de deshemoglobinización sin alterar la morfología del parasito.
• Verificar que la muestra este completamente seca para que no se desprenda
• Sumergir la lamina en una solución de azul de metileno por dos segundos
• Escurrir la lamina sobre una gasa o papel absorbente para eliminar el exceso de azul de metileno
• Introducir la lamina en un recipiente que contenga una solución amortiguadora pH 7.2, por dos segundos
• Esta solución se cambia cada vez que tenga mucho tinte azul proveniente del azul de metileno
• Cuando las muestras precoloreadas han tomado un exceso de azul de metileno fosfatado, se pueden volver a enjuagar para evitar muestras muy oscuras
• Deje escurrir las laminas para continuar la coloración
• En los casos en que no es posible colorear inmediatamente, se procede a secar los porta objetos a temperatura ambiente o con calor, suave y de manera rápida para prevenir el desarrollo de hongos. Se debe evitar la sobreexposición al calor porque se fija la hemoglobina de los glóbulos rojos.
2.5 Coloración
Después de la deshemoglobinización, la coloración permite la diferenciación de las estructuras parasitarias. El color esperado para la cromatina es el rojo; para el citoplasma es azul y el pigmento malárico varía entre el amarillo y el café oscuro.
• Por cada lámina que se necesita colorear, se adicionan 3 ml de solución amortiguadora, una gota de solución A y una gota de solución B en un tubo, y se mezcla suavemente por inversión
• Las muestras se colocan hacia la concavidad de la lámina de coloración; se adiciona la solución colorante evitando la formación de burbujas y se deja actuar según el tiempo estandarizado de la coloración. La posición invertida de la gota gruesa permite una deshemoglobinización completa por el alto peso molecular de la hemoglobina
• Pasado el tiempo de coloración, coloque las laminas en posición vertical en el soporte y deje escurrir. No necesita lavar la muestra ya que puede desprenderla.
