Métodos Particulares Empleados en La Caracterización Biológica del Tumor Quimioinducido (CETA)

Latencia y Supervivencia

Latencia

Se seleccionaron 20 ratones machos IBF1 a quienes se les realizó trasplante de CETA según procedimiento explicado anteriormente. Las observaciones del prendimiento tumoral se realizaron a partir de las 24 horas de efectuado el mismo y volcadas en gráfico confeccionado al efecto.

Necropsia efectuada a uno de los animales al final del primer ciclo de trasplante donde se aprecia tumoración implantada en región axilar. Pieza quirúrgica disecada (CETA- A851) para ser trasplantada a nuevos receptores .

Supervivencia

Se seleccionaron 53 ratones machos IBF1 a quienes se les trasplantó el tumor CETA obtenido de los pases Nº 4, 15 y 27. Las defunsiones durante el período de duración de los experimentos fueron registrados en un libro de control, considerando como día 0 la fecha de implantación del tumor. Con el fallecimiento del último animal de cada estudio, se procedió al análisis de la sobrevida en los receptores de CETA en diferentes etapas del ciclo de trasplante seriado

Diseño Experimental para El Estudio de la Respuesta de CETA a La Monoquimioterapia

Se seleccionaron 52 ratones IBF1 hembras a las cuales se les trasplantó el tumor CETA en región axilar siguiendo metodología descrita.

En el presente estudio se emplearon 4 drogas antitumorales: la Ciclofosfamida (CFM) VEB Jenapharm, Alemania; Metrotexate (MTX) Medexport, Rusia; Bleomicin (BLEO) Nippon Kayaku Co., Ltd., Tokyo; Cisdiamino dicloro platino II (cis DDP), Empresa Laboratorios Farmacéuticos “Mario Muñoz”, Habana, Cuba. Todas las sustancias fueron administradas por la vía intraperitoneal durante 5 días consecutivos una vez transcurridas 48 horas del trasplante.

Para su mejor comprensión a continuación presentamos un resumen gráfico:

Las dosis diarias administradas con cada medicamento fueron las siguientes:

CFM: …..25 mg/Kg (9 animales)
BLEO:…..2 mg/Kg (9 animales)
MTX: …..1 mg/Kg (9 animales)
DDP: …..1 mg/Kg (9 animales)

Nota: Fueron preparados dos grupos de 8 animales cada uno como controles del experimento.

La evaluación de la actividad antineoplásica se realizó sobre la base de la supervivencia y por las medidas del volumen tumoral durante la evolución del experimento una vez concluídos los tratamientos antitumorales.

La disminución del volumen tumoral se calculó empleando fórmulas consignadas anteriormente.

Diseño Experimental para Evaluar El Carácter Inmungénico de CETA y su Conducta en Parentales

Inmunogenicidad tumoral “in vivo”

Se seleccionaron 38 ratones machos IBF1 que fueron divididos en dos grupos de 21 y 17 animales a quienes se le inocularon diferentes concentraciones de CETA ajustados volumétricamente a 1:2 y 1:1 respectivamente. Cada animal recibió 0,05 ml de suspensión tumoral.

Este experimento tuvo una particularidad , se escogió como localización anatómica para la inoculación del tumor la región plantar (en pata derecha) siendo amputada la misma con margen de tejido sano a los 14 días de evolución.

Ilustración de metódica experimental para determinación del carácter inmunogénico.

Una vez terminada esta primera etapa se les reinoculó a los 14 días en pata izquierda una suspensión tumoral siguiendo el mismo método descrito anteriormente para cada grupo experimental. A su vez se seleccionaron 16 animales con similares características de tiempo y peso corporal quienes recibieron en ese momento, siguiendo el mismo método, la primera exposición al tumor. Estos animales fueron considerados controles del experimento.

La evaluación de los prendimientos y regresiones tumorales en los diferentes grupos se efectuó durante un período de 31 días. Los resultados son demostrados a través de gráficos confeccionados al efecto.

Para una mayor comprensión de los procedimientos realizados se ofrece el siguiente resumen gráfico:

Esquema de Inmunización Tumoral

Dosis: 0,05 ml de suspensión tumoral ajustada volumétricamente con suero fisiológico a 1:1 y 1:2.

Trasplantes en Parentales ( IBF1: IOR/Hab x C57 BL/6 Hab)

Se seleccionaron 20 ratones de la línea IOR/Hab y 10 de la línea C57BL/6 Hab a los cuales se les inoculó el tumor CETA siguiendo la técnica descrita.

Durante un período de 10 semanas fueron evaluadas las regresiones tumorales. Se realizó además medición de los 2 diamétros principales a fin de determinar los volúmenes tumorales siguiendo procedimiento matemático consignado anteriormente. Los resultados fueron volcados en gráficos consignados al efecto.

Diseño Experimental para El Estudio de La Radiosensibilidad del Tumor CETA

Se seleccionaron 25 ratones machos IBF1 a los cuales se les trasplantó CETA , con la particularidad que se cuantificó la suspensión inoculada, realizándose el conteo celular en solución del tripán azul mediante la cámara de Neubauer. De este modo cada animal recibió 2 x 106 Células tumorales que fueron trasplantadas en región femoral izquierda con el objetivo de proteger con mayor facilidad el resto de las estructuras anatómicas en el momento de la irradiación a través de un dispositivo confeccionado en el Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología de La Habana, Cuba.

Cada grupo experimental quedó constituído por 5 animales. Se comenzaron a irradiar 9 días después del trasplante con un ciclo de tratamiento compuesto por 5 administraciones (una diaria). Las mediciones de volumen tumoral se llevaron a cabo el día del inicio del tratamiento (valor 0), a las 24 horas después de terminado el ciclo radiante, a los 7, 14 y 21 días. Para su mejor comprensión presentamos a continuación el siguiente resumen gráfico:

Las dosis de irradiación empleadas oscilaron entre 2 y 6 Gray (Gy) en las diferentes series experimentales, administradas por un equipo ROCUS con fuente de irradiación Cobalto 60.

Los cálculos de los volúmenes tumorales y de los índices de inhibición tumoral se efectuaron según procedimientos matemáticos descritos.

Diseño Experimental para La Evaluación de La Respuesta de CETA al EGFh-recombinante

Se seleccionaron 10 ratones IBF1 machos a quienes se les trasplantó el tumor CETA en región axilar, con la particularidad que se cuantificó la suspensión inoculada, realizándose el conteo celular en solución tripán azul mediante cámara de Neubauer. De este modo cada animal recibió 1 x 106 células tumorales (pase #45-ciclo “in vivo”).

El EGFh recombinante fue obtenido en el Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología de Cuba (C.I.G.B). La máxima dosis terapéutica elegida fue de 20mg/Kg de peso. La vía de administración fue subcutánea y las inyecciones diarias durante un período total de 10 días.

Se preparó un grupo control de 10 animales con similar método de siembra tumoral, pero sin tratamiento.

Para su mejor comprensión a continuación presentamos un resumen gráfico:

inóculo tumoral: …………1 x 106 células

administración de EGFh-r:

– dósis terapéutica:…..20 mg/Kg de peso *
– vía: subcutánea
– frecuencia: diaria
– tiempo: 10 días

* Para determinar la dósis terapéutica se diseñó inicialmente un experimento de toxicidad crónica.

La evaluación de la respuesta tumoral ante dosis de EGFh-r se realiza sobre la base de curvas de sobrevida.