Cambios en la Expresión de Glicanos durante una Gingivitis

MATERIALES Y METODOS

MODELO DE GINGIVITIS EXPERIMENTAL

La muestra estuvo constituida por 3 voluntarios de sexo masculino, con edades entre 27 y 34 años, que gozaban de buena salud a la fecha de la investigación y con su dentición completa y sin restauraciones que pudiesen aumentar la acumulación de placa bacteriana. A los tres se les realizó la historia médico – odontológica que se emplea rutinariamente en el Centro de Especialistas CES de Sabaneta. Uno de los voluntarios ere fumador crónico y otro ocasional. Para determinar su estado clínico de salud gingival se les hizo un examen que incluyó el índice de placa de Silness y Loe22gingival modificado de Lobene y col23. En esta investigación se utilizó la técnica de boca dividida para poder obtener en un mismo individuo los parámetros clínicos de salud e inflamación que se estaba desarrollando en la encía con el fin de correlacionarlo con los resultados obtenidos. En la hemiarcada superior izquierda se establecieron los parámetros clínicos de salud mediante procedimientos de higiene oral y en la hemiarcada superior derecha los parámetros clínicos de inflamación, suprimiendo todas las medidas higiénicas.

Dos semanas antes de iniciar el experimento se implementó, para toda la boca, un régimen de higiene oral constituido por:

a. Cepillado y uso de la seda dental.
b. Control de placa (pastilla reveladora)
c. Profilaxis cada tres días.

Las zonas de tejido seleccionado para observación fueron las papilas gingivales, así: dientes 24, 25 y 26 (áreas experimentales). En estas áreas se suspendió todo tipo de higiene oral (cepillado y seda dental o cualquier método alterno) durante 14 días, para permitir el acúmulo espontáneo e ininterrumpido de placa. Se seleccionó el período experimental de 14 días porque permite observar clínica e histológicamente los cambios característicos de los estadios inicial y temprano de la gingivitis24.

MEDICIÓN DEL GRADO DE INFLAMACIÓN

El índice de placa se utilizó para distinguir claramente entre la severidad y la localización de agregados de placa blanda durante el período experimental y se registró en las papilas gingivales de los dientes mencionados cada siete días durante 14 días, antes de la toma de las biopsias. El índice gingival modificado se utilizó para distinguir claramente entre la calidad de la encía (severidad de la lesión) y la localización de la lesión. Este índice omite el sangrado a la presión y favorece una evaluación no invasiva de la extensión y severidad de la inflamación gingival y la detección visual temprana de sus cambios; además, permite tomas una biopsia poco traumatizada. Se aplicó en las papilas gingivales y en las superficies de los dientes seleccionados cada siete días durante 14 días, antes de la toma de las biopsias. Un solo examinador se encargó del registro de ambos índices y de la toma de las muestras de tejido gingival durante todo el período experimental.

TOMA DE BIOPSIAS

Se infiltró prilocaína (Citanest) a nivel del surco yugal correspondiente a la papila seleccionada, lo más lejos posible del área de la intervención para evitar la alteración del tejido que se iba a remover. Se utilizó un bisturí Bard Parker con hoja No. 15 para realizar en cada papila dos incisiones verticales y una horizontal que las unía. Las biopsias se tomaron a todos los sujetos en una misma sesión en los días señalados, con un tamaño promedio de 2 x 2 mm, bajo el siguiente esquema: día 0: una biopsia del área control y una del área experimental; día 7: una biopsia del área experimental; día 14: una biopsia del área experimental. En total se obtuvieron 12 biopsias: 3 de las áreas control y 9 de las áreas experimentales. El tejido se introdujo inmediatamente en un criovial a temperatura óptima de corte para poder realizar el procedimiento de congelación en nitrógeno líquido.

Se hicieron cortes de 7 m de grueso en un criostato y se fijaron en acetona grado reactivo hasta la ejecución del proceso de inmunohistoquímica.

PROCESAMIENTO DE LAS BIOPSIAS

A cada biopsia se le hicieron 9 cortes para terminar histológicamente el grado de inflamación. Se tiñeron con hematoxilina y eosina placas de cada individuo y de cada día para confeccionar un total de 108 placas, de las cuales se utilizaron 72 para el estudio inmunohistoquímico. Las 36 restantes (placas piloto) se utilizaron para tinción convencional con hematoxilina y eosina, con el fin de determinar la orientación que tendría el tejido en las placas y, además, el grado de inflamación del tejido en los diferentes días.

HISTOQUÍMICA

Se utilizaron las siguientes lectinas biotiniladas (Pierce Lab., rockport IL, USA):

  • Erythrina cristagalli (ECL)
  • Artocarpus integrifolia (Jacalina)
  • Aglutinina de arveja Pisum sativum (PSA)
  • Aglutinina de fermen de trigo (WGA)
  • Vicia villosa isolectina B4 (VvB4)
  • Dilichos biflorus (DBA)
  • Sophora joponica (SJA)
  • Ulex europaeus 1 (UEA-19

La unión de las lectinas biotiniladas se detectó por medio de avidina, una glicoproteína tetramérica con gran afinidad por la biotina, y de perioxidasa biotilinada, la cual transforma “in situ” el sustrato AEC (3-amino, 4-etil carbazole) en un material insoluble de color marrón cuando se incuba en presencia de peróxido de hidrógeno, siguiendo una técnica previamente descrita25. Se realizaron lavados con PBS (pH 7.2) durante 15 minutos y se hizo la contratinción con hematoxilina de Mayer durante un minuto. Enseguida se lavaron las placas en agua durante cinco minutos y finalmente se montaron en gelatina glicerinada.

Se procedió a observar en un microscopio de luz para determinar los sitios de unión de lectina a las diferentes estructuras del tejido gingival y se determinó la adhesión de las lectinas a los componentes de epitelio oral externo (EOE) y el tejido conectivo (TC).

RESULTADOS

Los patrones de expresión de las ocho lectinas utilizadas se muestran en la Tabla de la página siguiente. Los sujetos participantes en el experimento se identifican en ella con los números 1, 2 y 3. Entre paréntesis se indica el grupo sanguíneo de cada uno.

Es necesario aclarar que para la evaluación de la intensidad la tinción se utilizaron criterios subjetivos debido a la falta de métodos cuantitativos de mayor sensibilidad.

Como se registraron patrones de expresión muy intensos con algunas lectinas a nivel del tejido conectivo, se hace relación a su presencia o ausencia en ese tejido.

Con la lectina UEA-1 específica para el antígeno fucosilado H, se observó una expresión propia para vasos sanguíneos (endotelio vascular) en el tejido conectivo, que revela aumento en los tejidos más inflamados.

Los patrones de expresión observados fueron comparables en los tres individuos, con excepción de las lectinas específicas para determinantes del grupo sanguíneo (A, B, O).

En general, se apreció un leve o discreto aumento progresivo en la unión de las lectinas al epitelio oral externo a medida que progresaba el proceso inflamatorio.

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