Cambios en la Expresión de Glicanos durante una Gingivitis

ESTUDIO HISTOQUÍMICO DE LOS CAMBIOS EN LA EXPRESIÓN DE GLICANOS DURANTE UNA GINGIVITIS EXPERIMENTAL EN HUMANOS*

Félix Alejandro Mejía Madrid1, Julio Roberto Garzón Sánchez2, Gabriel J. Cadavid Velásquez3,
John Santiago Mejía Tobón4, Rodrigo Restrepo Molina5.

*Investigación para optar al título de Especialistas en Prótesis Periodontal.
1. Odontólogo CES 1990; estudiante del programa de Prótesis Periodontal, CES, Medellín, 1995.
2. Odontólogo Escuela Colombiana de Medicina 1989; estudiante del Programa de Prótesis Periodontal, CES, 1995.
3.M.Sc., U. De Illinois, USA; Jefe, División de Investigaciones, Facultad de Odontología, CES.
4. Master en Ciencias, Instituto Politécnico Nacional, México D.F.; Profesor CES.
5. Médico Patólogo, Universidad de Caldas, Manizales; Clínica Medellín.

RESUMEN

Mejía FA, Garzón JR, Cadavid GJ, Mejía JS, Restrepo R. Estudio histoquímico de los cambios en la expresión de glicanos durante una gingivitis experimental en humanos. En tres voluntarios sanos se indujo un modelo de gingivitis en la hemiarcada superior derecha (14 días sin ninguna medida de higiene oral); la hemiarcada superior izquierda sirvió como control. Se tuvo el propósito de demostrar los patrones de expresión de diferentes residuos glicosídicos usando un grupo de ocho lectinas biotiniladas en encía sana y enferma. Se tomaron biopsias por congelación en los días 0, 7 y 14 del experimento y se procesaron con la técnica histoquímica de la inmunoperoxidasa.- Fue posible determinar la adhesión selectiva de las lectinas a las diferentes estructuras de los tejidos epitelial y conectivo de la encía y se observó un cambio en la expresión de residuos sacáridos a medida que avanzaba la inflamación experimental, posiblemente atribuible a la creación de criptoepítopes mediante el clivaje del azúcar terminal de los glicanos, a la posible acción de una transferasa y a la especificidad de las lectinas por el grupo sanguíneo del paciente al que pertenecía el tejido bajo examen.

Palabras clave: Lectinas, Inflamación gingival, Inmunohistoquímica.

ABSTRACT

Mejía FA, Garzón JR, Cadavid GJ, Mejía JS, Restrepo R. Glycan expression in healthy and diseased periodontium: A histochemical comparative pilot study. An experimental gingivitis model achieved by the supression of all oral hygiene methods during 14 days was induced int he rigth maxillary quadrant of three male healthy volunteers. The left maxillary quadrant was used as a control site. The objective of the study was to reveal the expressiion patterns of the different glycosidic residues with the use of eight biotinized lectins in healthy and diseased periodontium. Biopsies werw taken and immersed in liquid nitrogen on days 0,7 and 14 of the esperiment and were processed with teh immunoperioxidase histochemical technique.- It was possible to determine lectin seletive adhesion to different structurres of the epithelial and connective tissues of the periodontium. Additionally, a change in the expressión of sacarose residues as teh experimental inflammation progressed was observed. This was possibly due to the creation of cryptoepitopes through cleavage of glycan terminal sugars, to the action of a transferase and to lectin specificity for the blood type group of teh individual.

Key Words: Lectins, Gingival inflammatiion, Histochemistry.

INTRODUCCIÓN

La gingivitis, definida simplemente como la inflamación de la encía, es el preámbulo de la periodontitis, la mayor causa de pérdida de dientes en adultos a nivel mundial. La gingivitis se inicia por la acción de sustancias tóxicas e irritantes sobre la encía, las cuales son liberadas por la flora de la placa bacteriana supragingival y por mediadores de la respuesta inflamatoria del huésped1.

La enfermedad se ha dividido en tres estadios, de acuerdo con los eventos histopatológicos que ocurren: lesiones inicial, temprana y establecida2. La lesión inicial (4 días) se caracteriza por una reacción inflamatoria aguda (aumento del fluido crevicular, migración de PMN), que no es evidente clínicamente3. La lesión temprana sigue a la inicial después de siete días de acumulación de placa, puede persistir durante 21 días o más y es clínicamente detectable como gingivitis4, 5; el infiltrado es dominado por linfocitos (75%), macrófagos y algunas células plasmáticas6. Después de un período variable, la lesión temprana evoluciona a una lesión temprana evoluciona a una lesión establecida, caracterizada por un incremento adicional en el tamaño de la encía, con predominio de células plasmáticas y linfocitos B en el infiltrado; los signos clínicos de inflamación son evidentes y pueden ser severos7,8. El paso del tiempo y el aumento del acúmulo de placa conducen a una periodontitis, en la que es mucho más evidente la formación de una bolsa periodontal y se aprecia la destrucción del soporte óseo de los dientes9.

El depósito de una delgada película sobre la superficie del diente y sobre la encía es el primer paso para la formación de placa13, cuyo crecimiento resulta de la colonización bacteriana sobre la película adquirida.

La flora bacteriana comensal de la cavidad por las propiedades del medio. El establecido de la placa bacteriana comensal sigue las etapas de adquisición, distribución y adherencia de los microorganismos. En estado de salud esta flora está constituida principalmente por cocos y bacilos grampositivos, algunos anaerobios facultativos y, en menor proporción, por bacteriodes y espiroquetas. Para la iniciación de la gingivitis se requiere un cambio en la flora, principalmente de miembros de género Actinomyces y estreptococos y de especies gramnegativas como F. Nucleatum, V. Parvula y Treponema sp.10,11

La interacción entre las bacterias y el huésped puede desencadenar la síntesis y la expresión de diferentes moléculas y ligandos que determinan la intensidad de la respuesta inmunológica en defensa contra el microorganismo. Las interacciones que ocurren en los procesos de adhesión celular, bacteriana, o ambas, son controladas por las moléculas de adhesión celular (MAC), de las cuales se reconocen cuatro grupos principales, a saber: integrinas, superfamilias de las inmunoglobulinas, moléculas de adhesión tipo lectina y las del grupo Cd44 o grupo Hermes. Todas están ampliamente distribuidas, no solamente en las células del sistema inmune, sino también en otros tejidos, como el endotelio. La selectividad de las MAC por sus ligandos específicos es un determinante fundamental de la naturaleza de la respuesta inflamatoria, facilitando la migración selectiva de PMN, linfocitos o macrófagos hacia el tejido afectado; Pueden igualmente mediar los procesos de adherencia e invasión de diversos microorganismo. La estimulación de las células inflamatorias (macrófagos principalmente) aumenta la secreción de mediadores inflamatorios como la interleuquina1 (IL-1), el interferón gamma (IFN-g ) y el factor de necrosis tumural alfa (TNF-a ), que amplifican la respuesta inflamatoria. Este ciclo de retroalimentación positiva sólo se logra controlar cuando el agente agresor es eliminado12.

Se han postulado dos mecanismos que explican la colonización microbiana de las mucosas:

1. Producción de polisacáridos extracelulates por microorganismos14,15, los cuales son viscosos y forman una matriz intermicrobiana gelatinosa que atrapa bacterias16,
2. Expresión de adhesinas con especifidad por ligandos de naturaleza sacarídica o protéica17.

Muchas de estas adhesinas son lectinas con especificidad por diversas estructuras sacáridas. Con frecuencia las lectinas expresadas por los microorganismos son específicas para sacáridos, que en condiciones normales no son accesibles, por lo que se hace necesaria la expresión simultánea de una proteasa y/o glicosidasa (de origen bacteriano o de células inflamatorias) que hacen que se exponga el residuo sacárido correspondiente (criptoepítope). Este es uno de los eventos más importantes en la fisiopatología de la gingivitis, ya que simultáneamente se remueve el sacárido ligando de las bacterias no patógenas y se expone otro ligando para bacterias patógenas18. En pacientes con enfermedad periodontal se ha detectado en el fluido crevicular un elevado número de enzimas de tipo de las proteasas (tripsina, colagenasa) y de varias glicosidasas (neuraminidasas), las cuales alcanzan sus mayores niveles en los sitios de máxima colonización bacteriana18.

El objetivo del presente estudio fue investigar la expresión de diferentes residuos sacáridos por medio de lectinas en la encía humana en un modelo de gingivitis experimental, para tratar de definir si en realidad se generan criptoepítopes de naturaliza sacarídica en las inmediaciones del sitio de colonización bacteriana. Las lectinas son proteínas de origen no inmune con capacidad de reconocer con alta estereoespecificidad los glicanos asociados a lípidos o proteínas; han sido ampliamente usadas en pruebas histoquímicas para localizar la expresión de determinados glicanos en cortes histológicos19,20,21.

MATERIALES Y METODOS

MODELO DE GINGIVITIS EXPERIMENTAL

La muestra estuvo constituida por 3 voluntarios de sexo masculino, con edades entre 27 y 34 años, que gozaban de buena salud a la fecha de la investigación y con su dentición completa y sin restauraciones que pudiesen aumentar la acumulación de placa bacteriana. A los tres se les realizó la historia médico – odontológica que se emplea rutinariamente en el Centro de Especialistas CES de Sabaneta. Uno de los voluntarios ere fumador crónico y otro ocasional. Para determinar su estado clínico de salud gingival se les hizo un examen que incluyó el índice de placa de Silness y Loe22gingival modificado de Lobene y col23. En esta investigación se utilizó la técnica de boca dividida para poder obtener en un mismo individuo los parámetros clínicos de salud e inflamación que se estaba desarrollando en la encía con el fin de correlacionarlo con los resultados obtenidos. En la hemiarcada superior izquierda se establecieron los parámetros clínicos de salud mediante procedimientos de higiene oral y en la hemiarcada superior derecha los parámetros clínicos de inflamación, suprimiendo todas las medidas higiénicas.

Dos semanas antes de iniciar el experimento se implementó, para toda la boca, un régimen de higiene oral constituido por:

a. Cepillado y uso de la seda dental.
b. Control de placa (pastilla reveladora)
c. Profilaxis cada tres días.

Las zonas de tejido seleccionado para observación fueron las papilas gingivales, así: dientes 24, 25 y 26 (áreas experimentales). En estas áreas se suspendió todo tipo de higiene oral (cepillado y seda dental o cualquier método alterno) durante 14 días, para permitir el acúmulo espontáneo e ininterrumpido de placa. Se seleccionó el período experimental de 14 días porque permite observar clínica e histológicamente los cambios característicos de los estadios inicial y temprano de la gingivitis24.

MEDICIÓN DEL GRADO DE INFLAMACIÓN

El índice de placa se utilizó para distinguir claramente entre la severidad y la localización de agregados de placa blanda durante el período experimental y se registró en las papilas gingivales de los dientes mencionados cada siete días durante 14 días, antes de la toma de las biopsias. El índice gingival modificado se utilizó para distinguir claramente entre la calidad de la encía (severidad de la lesión) y la localización de la lesión. Este índice omite el sangrado a la presión y favorece una evaluación no invasiva de la extensión y severidad de la inflamación gingival y la detección visual temprana de sus cambios; además, permite tomas una biopsia poco traumatizada. Se aplicó en las papilas gingivales y en las superficies de los dientes seleccionados cada siete días durante 14 días, antes de la toma de las biopsias. Un solo examinador se encargó del registro de ambos índices y de la toma de las muestras de tejido gingival durante todo el período experimental.

TOMA DE BIOPSIAS

Se infiltró prilocaína (Citanest) a nivel del surco yugal correspondiente a la papila seleccionada, lo más lejos posible del área de la intervención para evitar la alteración del tejido que se iba a remover. Se utilizó un bisturí Bard Parker con hoja No. 15 para realizar en cada papila dos incisiones verticales y una horizontal que las unía. Las biopsias se tomaron a todos los sujetos en una misma sesión en los días señalados, con un tamaño promedio de 2 x 2 mm, bajo el siguiente esquema: día 0: una biopsia del área control y una del área experimental; día 7: una biopsia del área experimental; día 14: una biopsia del área experimental. En total se obtuvieron 12 biopsias: 3 de las áreas control y 9 de las áreas experimentales. El tejido se introdujo inmediatamente en un criovial a temperatura óptima de corte para poder realizar el procedimiento de congelación en nitrógeno líquido.

Se hicieron cortes de 7 m de grueso en un criostato y se fijaron en acetona grado reactivo hasta la ejecución del proceso de inmunohistoquímica.

PROCESAMIENTO DE LAS BIOPSIAS

A cada biopsia se le hicieron 9 cortes para terminar histológicamente el grado de inflamación. Se tiñeron con hematoxilina y eosina placas de cada individuo y de cada día para confeccionar un total de 108 placas, de las cuales se utilizaron 72 para el estudio inmunohistoquímico. Las 36 restantes (placas piloto) se utilizaron para tinción convencional con hematoxilina y eosina, con el fin de determinar la orientación que tendría el tejido en las placas y, además, el grado de inflamación del tejido en los diferentes días.

HISTOQUÍMICA

Se utilizaron las siguientes lectinas biotiniladas (Pierce Lab., rockport IL, USA):

• Erythrina cristagalli (ECL)
• Artocarpus integrifolia (Jacalina)
• Aglutinina de arveja Pisum sativum (PSA)
• Aglutinina de fermen de trigo (WGA)
• Vicia villosa isolectina B4 (VvB4)
• Dilichos biflorus (DBA)
• Sophora joponica (SJA)
• Ulex europaeus 1 (UEA-19

La unión de las lectinas biotiniladas se detectó por medio de avidina, una glicoproteína tetramérica con gran afinidad por la biotina, y de perioxidasa biotilinada, la cual transforma “in situ” el sustrato AEC (3-amino, 4-etil carbazole) en un material insoluble de color marrón cuando se incuba en presencia de peróxido de hidrógeno, siguiendo una técnica previamente descrita25. Se realizaron lavados con PBS (pH 7.2) durante 15 minutos y se hizo la contratinción con hematoxilina de Mayer durante un minuto. Enseguida se lavaron las placas en agua durante cinco minutos y finalmente se montaron en gelatina glicerinada.

Se procedió a observar en un microscopio de luz para determinar los sitios de unión de lectina a las diferentes estructuras del tejido gingival y se determinó la adhesión de las lectinas a los componentes de epitelio oral externo (EOE) y el tejido conectivo (TC).

RESULTADOS

Los patrones de expresión de las ocho lectinas utilizadas se muestran en la Tabla de la página siguiente. Los sujetos participantes en el experimento se identifican en ella con los números 1, 2 y 3. Entre paréntesis se indica el grupo sanguíneo de cada uno.

Es necesario aclarar que para la evaluación de la intensidad la tinción se utilizaron criterios subjetivos debido a la falta de métodos cuantitativos de mayor sensibilidad.

Como se registraron patrones de expresión muy intensos con algunas lectinas a nivel del tejido conectivo, se hace relación a su presencia o ausencia en ese tejido.

Con la lectina UEA-1 específica para el antígeno fucosilado H, se observó una expresión propia para vasos sanguíneos (endotelio vascular) en el tejido conectivo, que revela aumento en los tejidos más inflamados.

Los patrones de expresión observados fueron comparables en los tres individuos, con excepción de las lectinas específicas para determinantes del grupo sanguíneo (A, B, O).

En general, se apreció un leve o discreto aumento progresivo en la unión de las lectinas al epitelio oral externo a medida que progresaba el proceso inflamatorio.

DISCUSIÓN

Los carbohidratos presentes en las superficies celulares y en la matriz extracelular están implicados en una gran variedad de fenómenos biológicos tales como fertilización, embriogénesis, morfogénesis, migración celular19 y receptores para hormonas y tóxinas como sitios blancos para la adherencia de microorganismo y como mecanismos de defensa inmune26,27.

En el presente estudio se utilizaron ocho lectinas biotiniladas para investigar la expresión de residuos sacáridos en tejido gingival humano sano (D-0) y enfermo (D-7 y D-14) de una gingivitis experimental. Es importante resaltar que el modelo pretendió evaluar el proceso inflamatorio gingival en sus estadíos iniciales y teniendo como control al mismo individuo. En esto difiere de investigaciones anteriores en las que se obtuvieron biopsias de pacientes que sufrían de enfermedad periodontal crónica de evolución natural y en las cuales no se determinaba el estadío real en que se encontraba la enfermedad28,29,30.

Es posible afirmar que la expresión de residuos sacáridos en los estados de salud o de enfermedad del tejido gingival puede tener alguna relación directa con el incremento del proceso inflamatorio, lo mismo que con el grado de diferenciación celular de los estratos celulares del epitelio29 y con el grupo sanguíneo del paciente al que pertenece el tejido examinado28.

Interesante lo que se observó con la DBA, específica para N-acetilgalactosamina y para grupos sanguíneos A1> A2,30 la cual mostró dicha especificidad en este estudio, pues el único sujeto perteneciente al grupo B, resultó negativo para ella, mientras que en los otros dos, pertenecientes al grupo A, fue positiva en el EOE28.

En el tejido conectivo se observó una intensa reacción con las lectinas ECL y JAC, que reconocen galactosas terminales en posiciones a y b respectivamente. De igual intensidad fue la reacción con la lectina específica para residuos de manosa (PSA) y N-acetil glucosamina/ácido siálico (WGA). Con ECL, JAC, y EUA-1 se apreció un patrón de expresión que varió de manera discreta a medida que avanzaba el proceso inflamatorio. La evidencia registrada sugiere que durante la gingivitis se establece un proceso de depleción selectiva de sacáridos en el tejido conectivo, especialmente de residuos de galactosa.

Estos cambios en la expresión de azúcares en el tejido conectivo pueden ser producidos por proteasas o glicosidasas del huésped o de los microorganismos. Dos mecanismos podrían explicar este fenómeno: el primero se relaciona con la creación de criptoepítopes mediante el clivaje del azúcar terminal de los glicanos; el segundo incluye la eventual acción de una transferasa que ocupa el posible sitio de unión para una lectina específica.

El patrón de unión de las lectinas al epitelio escamoso, tanto de la encía como de la piel humana, ha sido descrito como una distribución zonal o regional en los estratos individuales de cada epitelio. En general, es estrato basal contiene pocos sitios de unión mientras que los estratos espinoso y granular reaccionan marcadamente y el estrato córneo (queratinizado) no demuestra unión con lectinas31,32. El presente reporte se aleja de lo anterior, ya que con la mayoría de las lectinas utilizadas, el estrato basal expresó un variado patrón de unión.

De las ocho lectinas utilizadas, la PSA y la WGA, que identifican residuos sacáridos de los grupos galactosa, manosa/glucosa y N-acetilglucosamina respectivamente, mostraron un discreto aumento en el patrón de expresión (tanto en la cantidad de tejido teñido, como en la intensidad de la expresión) durante el período experimental. La excepción fue la jacalina, que identifica residuos de galatosa en posición b , la cual exhibió una tendencia a la disminución en su expresión durante la evolución de la gingivitis.

Los patrones de expresión de lectinas observados en el EOE permiten sugerir que a medida que la gingivitis avanza se producen cambios en la expresión de azúcares como galactosa, manosa y N-acetilglucosamina, los cuales pueden ser consecuencia de la activación de células epiteliales, producida pro mediadores de la inflamación liberados desde el tejido conectivo.

Es importante resaltar el comportamiento de algunas lectinas específicas para antígenos de grupo sanguíneo. No se observó tinción para lectinas específicas de grupo sanguíneo A (DBA) o B (SJA) en tejido conectivo, pero sí para su precursor, el antígeno H. La UEA-1, que es específica para el grupo sanguíneo H(0) mostró tinción selectiva de células endoteliales y epiteliales.

CONCLUSIÓN

Se observó un cambio en la expresión de residuos sacáridos en la encía humana, tanto en el tejido conectivo como en el epitelio oral externo, a medida que el proceso inflamatorio de la gingivitis experimental avanzaba.

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