Síndrome Antifosfolípido/Cofactor

Inmunología y Mecanismos Patogénicos. Estado del Arte

*Antonio de Castro Andrade, Internista, Jefe de Postgrado de Medicina de
Urgencias y Profesor de Medicina Interna CEC. Internista Hospital Manuel Uribe Ängel
**Luis Fernando Pinto Peñaranda, Internista-Reumatólogo.
Profesor de Medicina Interna UPB. Internista Reumatólogo
Clínica Universitaria Bolivariana y Congregación Mariana.

Resumen

El síndrome antifosfolípido (SAF) es un desorden que produce trombosis recurrente tanto en el lecho arterial como en el venoso, pérdida fetal recurrente y trombocitopenia, todo lo anterior asociado con la presencia de anticuerpos que ligan fosfolípidos. Los anticuerpos antifosfolípidos (aPL) son una familia de inmunoglobulinas que inicialmente se pensaba reconocían fosfolípidos aniónicos. La evidencia reciente soporta la especificidad de los aPL para complejos proteínas-fosfolípidos en vez de fosfolípidos solos. Algunos estudios sugieren que los aPL reconocen proteínas (b2-glicoproteína I, protrombina) en ausencia de fosfolípidos. En dichos estudios las proteínas blanco de los aPL han sido expuestas a superficies con carga negativa permitiendo la reconfiguración de éstas y la exposición de neoepítopes. Una variedad de proteínas han sido implicadas como blanco de los aPL, dentro de éstas se incluyen: b2-glicoproteína I, protrombina, proteína C, proteína S y la trombomodulina.

Summary

The antiphospholipid syndrome (APS) is a disorder involving recurrent arterial or venous thrombosis, recurrent pregnancy losses, and trombocytopenia associated with the presence of phospholipid – binding antibodies. Antiphospholipid antibodies (aPL) are a family of immunoglobulins wich were originally thought to recognize anionic phospholipids (PL). Recent evidence supports specificity of aPL for protein-PL complexes rahter than aPL alone. Some studies suggest aPL recognize proteins (b2-glicoprotein I, prothrombin) in the absence of PL. In these studies, the protein targets for aPL have been exposed to negatively charged surfaces, allowing for potencial reconfiguration of the protein and exposure of neoepitopes. A variety of proteins have been implicated as targets for aPL. These include: b2-glicoprotein I, prothrombin, protein C, protein S, and thrombomodulin.

Introducción

Los anticuerpos antifosfolípidos (aPL) son un grupo heterogéneo de anticuerpos que se detectan en el suero de pacientes con una variedad de condiciones, incluyendo enfermedades autoinmunes como el lupus eritematoso sistémico (LES), infecciones (sífilis, virus de inmunodeficiencia humana-VIH), y enfermedades linfoproliferativas (paraproteinemias, mieloma, leucemias linfocíticas) o luego del uso crónico de medicamentos como la clorpromazina y procainamida. Subgrupos de estos anticuerpos están asociados con trombosis recurrentes tanto arteriales como venosas, pérdida fetal recurrente, trombocitopenia, y otras manifestaciones clínicas que son denominadas colectivamente Síndrome Antifosfolípido/cofactor (SAF)1-2.

2. Fisiopatología

2.1. Fosfolípidos

Los fosfolípidos son compuestos polares con una estructura simple con 3 componentes básicos: una porción glicérida (diacilglicerol), un grupo fosfodiester y una porción sustituida. La porción sustituida identifica a cada fosfolípido en particular de acuerdo a las bases sustitutivas que se agreguen (colina, serina, etanolamina, inositol, entre otros). El grupo fosfodiester liga la porción sustituida al diacilglicerol y es compartido por todos los fosfolípidos aniónicos. Estos grupos fosfodiester se consideraron por mucho tiempo como los epítopes ligados por los aPL3.

Los fosfolípidos aniónicos (cardiolipina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol y ácido fosfatídico), tienen la capacidad de ligar los aPL a diferencia de los fosfolípidos neutros. La célula endotelial en reposo expresa hacia afuera fosfolípidos neutros (esfingomielina y fosfatidilcolina) y hacia adentro fosfolípidos aniónicos (fosfatidilserina). La activación de la célula endotelial induce translocación de estos por acción de una aminotranslocasa específica dependiente de calcio. Esta enzima invierte parcialmente el sentido de la disposición de la bicapa fosfolipídica. La consecuencia de esto es una asimetría en la distribución fosfolipídica de la superficie externa de la membrana de la célula endotelial4. La presencia de fosfatidilserina acelera la “reacción en tenaza” (activación del factor X por acción de los factores IXa, VIIIa y protrombinasa). La expresión permanente de fosfolípidos aniónicos aumenta la adhesión de proteínas catiónicas (b2GP-1 por ejemplo); este concepto explicaría la naturaleza del “receptor” de b2GP-1 en la célula endotelial no conocido hasta ahora5.

Los fosfolípidos son estructuras poco antigénicas y aunque tradicionalmente se consideró que los fosfolípidos aniónicos eran los blancos de los aPL la situación es más compleja. El planteamiento actual es que los aPL ligan complejo fosfolípidos/proteínas séricas o proteínas que sufren cambios conformacionales al unirse a fosfolípidos aniónicos (especialmente, pero no exclusivamente b2GP-1 y protrombina)6-9.

2.2. beta 2 Glicoproteína-1

La beta 2 glicoproteína-1 (b2GP-1) es una proteína con un peso molecular de 50 kD, es altamente glicosilada y con un alto contenido de prolina10. Su concentración plasmática es de 200 ug/ml y en un 40% se encuentra asociada a lipoproteínas. Su secuencia ha sido caracterizada tanto a nivel proteico como de nucleótidos11-14. Dichos estudios demuestran que esta compuesta de 326 aminoácidos (aa) precedida de una secuencia “líder” de 19 aa. La secuencia de aa es compartida en un 84% entre humanos y otras especies de mamíferos (murinos y bovinos). Pertenece a la superfamilia de proteínas de control del complemento (CCP), posee cinco dominios repetidos, de los cuales el 5° tiene una región carboxiterminal aberrante y es altamente catiónico por su gran contenido de lisina y arginina; además son críticos los residuos de cisteina en las posiciones 281 y 288. La sustitución de estas moléculas de cisteina o del quinto dominio por ingeniería genética anula la unión de la b2GP-1 a fosfolípidos aniónicos10, 15. En este dominio se ha determinado el sitio de unión tanto de fosfolípidos como de los ACL15-17. El gene humano de la b2GP-1 ha sido localizado en el cromosoma 1718. Aunque su papel fisiológico permanece incierto, es conocido que la b2GP-1 se une a sustancias con carga negativa como fosfolípidos, heparina, lipoproteínas, y plaquetas activadas. La b2GP-1 es un anticoagulante natural ya que inhibe la vía intrínseca de la coagulación, la actividad de protrombinasa, y la agregación plaquetaria dependiente de ADP19-20.

La heterogeneidad de los aPL comenzó a postularse cuando se demostró que estos reaccionaban no solamente con el suero de pacientes con sífilis sino también con el de pacientes con enfermedades autoinmunes como el LES21.

En 1990 tres grupos de investigadores de manera independiente y prácticamente simultánea reportan por primera vez que el antígeno para el anticuerpo en el sistema de ELISA no era la cardiolipina sino una proteína plasmática unida a ésta: la b2GP-122-24. El hallazgo se basó en la observación luego de la purificación de los aPL (a través de cromatografía de intercambio de iones o de afinidad de fosfolípidos), que estos no se unían a los fosfolípidos a menos que adicionara plasma o suero humano, o suero bovino. Posteriormente se determinó que los aPL asociados a infecciones no requieren de la presencia de la b2GP-1 para ligar la cardiolipina como si los de los encontrados en pacientes con LES, hallazgo este que generó mucho interés ya que estos últimos son los que se han relacionado con fenómenos tromboembólicos25. Desde entonces los aPL han sido vinculados con la cascada de la coagulación19-20. Hoy en día se piensa que los anticuerpos están dirigidos contra epítopes conformacionales que están presentes en la molécula de b2GP-1 que se exponen sólo al unirse esta a fosfolípidos aniónicos o a superficies oxidadas (epítopes crípticos) o que reaccionan directamente con la molécula nativa de b2GP-1 pero que necesitan estar en altas concentraciones debido a la baja afinidad de éstos26-28.

Diversos estudios han demostrado que los anti b2GP-1 tienen mayor sensibilidad y especificidad en la evaluación clínica de los pacientes con SAF29-32; es así como han sido descritos pacientes con SAF y valores no detectables de aPL en suero pero positivos para anti b2GP-133-34, también se ha reportado como los niveles de anti b2GP-1 se disminuyen de manera significativa durante el evento trombótico lo cual sugiere además que su medición seriada ayudaría a predecir qué pacientes estarían propensos a desarrollar trombosis35. En este último estudio no se encontró correlación entre los niveles de anti b2GP-1 y los de ACL, así como variación en los niveles de estos (ACL) antes, durante o después del evento clínico lo cual indica que estos anticuerpos tendrían diferencias inmunoquímicas; vale la pena anotar que la medición de ACL se hizo por la técnica convencional de ELISA mientras que los de anti b2GP-1 se midieron en placas no irradiadas. Dicho grupo había descrito previamente una disminución en los niveles de aPL al momento del episodio trombótico en 6 pacientes con LES, lo cual no se dio en el presente estudio de manera uniforme36.

La inmunogenicidad y patogenicidad de la b2GP-1 se ve sustentada por los estudios de Gharavi en modelos animales en los que demuestra que la inmunización de cepas NZW/NZBF1 con b2GP-1 inducen no solo la producción de anti b2GP-1 sino de ACL y que estas cepas cursan con prolongación del TPT, trombosis y pérdida fetal37.
En los criterios preliminares para la clasificación del Síndrome Antifosfolípido se incluyó la determinación de títulos altos de ACL-dependiente de b2GP-1 por la técnica de ELISA como uno de los requisitos diagnósticos en lo que a laboratorio respecta38.

2.3. Protrombina

La protrombina o factor II es sintetizada por los hepatocitos donde sufre modificaciones secundarias tales como carboxilación de los primeros diez residuos de glutamato de la región N-terminal a ácidos g-carboxiglutámico (dominio – GLA); La protrombina se une a los fosfolípidos aniónicos a través de este dominio. Tiene un peso molecular de 72 kD; es el zimógeno de una proteasa de serina, la trombina, y su concentración plasmática es de 100 ug/ml39. Fue identificada como cofactor desde 1959 por Loeliger40.

La protrombina unida a los fosfolípidos puede ser activada por el factor Xa en presencia del factor Va y concentraciones milimolares de calcio (complejo protrombinasa), a través de una hidrólisis selectiva de dos enlaces peptídicos dando lugar a la a-trombina, obteniéndose de esta forma la liberación del fragmento 1+2, el cual contiene el dominio-GLA; de lo anterior se deduce entonces que la trombina no tiene capacidad de unión a los fosfolípidos39.

Recientemente se ha descrito una variación genética en la región tres del gene de la protrombina (mutación 20210) que se asocia con niveles plasmáticos elevados de protrombina y una mayor incidencia de eventos trombóticos venosos; aparentemente mayores niveles plasmáticos de esta conllevan a una mayor generación de trombina lo que daría como resultado una excesiva formación de coágulos de fibrina y/o aumento en la activación plaquetaria41.

La trombina tiene un papel clave en la regulación hemostática:

• Ejerce retroalimentación positiva a través de la activación de los factores V y VIII.
• Ejerce retroalimentación negativa luego de unirse a la trombomodulina a través de la proteína C.
• Participa en la activación plaquetaria y en la protección del coágulo de fibrina frente a la fibrinólisis.
• Activa la célula endotelial para producir prostaciclina y óxido nítrico.

La presencia de trombomodulina determina si la trombina actúa como procoagulante o anticoagulante ya que al unirse a ésta pierde sus efectos protrombóticos39.

Los anticuerpos antiprotrombina se encuentran en un 50-90% de los pacientes con SAF, dependiendo del método de ELISA que se utilice; teniendo mayor rendimiento cuando se usa el complejo fosfolípido/protrombina mediado por calcio, como el antígeno de fase sólida. Este complejo no tiene restricciones a los movimientos laterales lo que permitiría una orientación apropiada ofreciendo mejores condiciones de unión a los anticuerpos, adicionalmente se pueden capturar a través de los iones de calcio complejos circulantes protrombina/ antiprotrombina42-44. Por otra parte los anticuerpos antiprotrombina pueden reaccionar con neoepítopes formados al unirse la protrombina al fosfolípido tal cual ocurre con la b2GP-1, de hecho ya se ha demostrado que la protrombina sufre un cambio conformacional al unirse a fosfolípidos aniónicos45.

Los anticuerpos antiprotrombina inhiben la activación de la protrombina por parte del complejo protrombinasa, y la conversión del factor X por los factores IXa y VIII46-47. Este efecto sinérgico en dos fases de la coagulación dependientes de fosfolípidos hace que pruebas de coagulación como el tiempo de coagulación de la kaolina (KCT), que depende de la generación de factor Xa y la activación de la protrombina, se vea afectado por la presencia de anticuerpos antiprotrombina48. El tiempo de dilución del veneno de la víbora de Russel (dRVVT), que evalúa selectivamente la conversión de protrombina es particularmente anormal con la presencia de anticuerpos anti b2GP-1 que inhibe la protrombina pero no la activación del factor X. Lo anterior explica el fundamento para la discriminación entre la actividad de LAC de anticuerpos antiprotrombina y anti b2GP-1 basada en la relación entre KCT y el dRVVT; así cuando la relación del primero es mayor que la del segundo exhibe perfil de KCT, lo que principalmente refleja anticuerpos antiprotrombina; cuando ocurre lo contrario es en la mayoría de las veces por anticuerpos anti b2GP-148. Lo anterior no significa que el perfil de cada uno se dé exclusivamente por antiprotrombina o anti b2GP-1 respectivamente, ya que como fue demostrada por Horbach la actividad de LAC está dada en la mayoría de los casos por el efecto combinado de ambos anticuerpos49.

Un estudio prospectivo evaluó el riesgo conferido por el perfil de KCT y/o dRVVT en 100 pacientes en una media de 37.5 meses y encontró que el tener perfil de dRVVT confería un riesgo relativo para trombosis de 5.25 (95% de intervalo de confidencia 1.17-23.50), en cambio el tener perfil de KCT aparecía asociado retrospectivamente con trombocitopenia moderada. Ninguno de los dos se relacionó con pérdida fetal recurrente50.

Varios estudios han demostrado que los anticuerpos antiprotrombina se correlacionan con la presencia de eventos trombóticos en el lecho venoso más no en el arterial, su presencia tampoco se ha relacionado con pérdida fetal51-53.

2.4. Vía de la trombomodulina

La trombomodulina (TM) es un receptor de trombina de alta afinidad presente en la membrana de las células endoteliales. Es muy estable y compacta debido a unos puentes disulfuro, tiene un peso molecular que cambia de 75 a 105 kD. Su largo dominio en la región NH2 terminal incluye a su vez tres dominios: uno necesario para la endocitosis, otro necesario para la activación de la proteína C por la trombina y por último uno rico en serina y treonina, que se ha definido importante en la infección por Plasmodium Falciparum. La TM también contiene un dominio hidrofobito que atraviesa la membrana y consta de 23 cha y una pequeña cola intracitoplasmática probablemente asociada con endocitosis y degradación54.

La TM es el cofactor endotelial responsable de la activación de la proteína C por la trombina. Parece también estar implicada en la fibrinólisis actuando también como cofactor de la carboxipeptidasa B (Inhibidor de la fibrinólisis activado por la trombina-TAFI)55.

Aunque el papel de la TM en estados inflamatorios no es del todo comprendido, está necesariamente vinculada a estos ya que la proteína C activada juega un papel anti-inflamatorio in vivo; no obstante su papel estaría limitada a los vasos sanguíneos ya que la TM no es un reactante de fase aguda como lo es el factor de von Willebrand (vWF) o el inhibidor del activador del plasminógeno (PAI-1)56. La TM está presente en el endotelio de todos los vasos: arterias, venas y capilares, es particularmente abundante en órganos con rica vascularización como pulmones y placenta; en esta última se localiza no solamente en los vasos sino también en el sincitiotrofoblasto; se expresa además por la mayoría de las células en contacto con los líquidos corporales (sangre, linfa, orina, líquido cefalorraquídeo), así como en algunas células sanguíneas particularmente monocitos y macrófagos, también se encuentra en pequeñas cantidades en megacariocitos y plaquetas, y en forma inactiva en los gránulos de los neutrófilos57.

Ante la presencia de citoquinas, neutrófilos activados y macrófagos la TM endotelial es dividida enzimáticamente, liberando fragmentos solubles que circulan en la sangre y son eliminados por la orina, esta es la denominada TM plasmática (pTM), y que es usada como marcador de daño endotelial en una gran variedad de enfermedades. Los valores de pTM varían de acuerdo a la edad, sexo, y grupo sanguíneo. Se ha visto además que sus valores tienen importante variación interpersonal, pero que permanecen constantes en una misma persona. Al ser excretada en la orina sus niveles se elevan en pacientes con falla renal54. Los niveles de pTM han sido estudiados en pacientes con LES y se han correlacionado con la actividad de la enfermedad58-60. Otros estudios han sugerido usar sus niveles como un marcador de actividad útil para predecir eventos trombóticos y evaluar la eficacia del tratamiento61.

Matsuda y colaboradores estudiaron en 20 mujeres con LES, 10 de las cuales tenían pruebas positivas para LAC, el efecto de una prueba de oclusión venosa prolongada sobre el activador del plasminógeno tisular (tPA), vWF, y pTM. Antes de la prueba sólo el tPA pudo diferenciar entre LAC positivos y LAC negativos, mientras que luego de la oclusión solo la pTM pudo hacerlo (niveles más altos en LAC positivos), sugiriendo que la pTM era el marcador de daño endotelial concomitante con la presencia de aPL. No obstante ninguno de los marcadores pudo seleccionar paciente con historia previa de trombosis ni de abortos recurrentes62.

2.5. Célula endotelial

Hoy en día son bien claras las funciones antitrombogénicas del endotelio; dentro de estas se pueden enumerar63:

• La producción de sustancias como la prostaciclina y el óxido nítrico que inhiben la función plaquetaria y producen vasodilatación.
• La secreción del activador del plasminógeno tisular (t-PA) que se encarga de promover la fibrinólisis.
• La producción de proteoglicanos similares a la heparina (heparan sulfato), los cuales se unen a la antitrombina para activarla y que así se encargue de inhibir al factor Xa y a la trombina.
• La producción del inhibidor del factor tisular, que se encarga de inactivar al factor tisular y al factor VIIa en presencia del Xa.
• La producción de la TM que es el cofactor endotelial responsable de la activación de la proteína C por la trombina.

Los aPL se unen al endotelio probablemente a través de la mediación de la b2GP-164-65; los posibles blancos antigénicos incluyen los fosfolípidos con carga negativa y otras moléculas cargadas como serían el heparan sulfato, y el TM; si bien los aPL son distintos, pueden coexistir, o, tener reacción cruzada con anticuerpos anticélula endotelial. Los aPL, los anticélula endotelial o ambos activan a las células endoteliales66. En presencia de b2GP-1 el suero de pacientes con SAF induce la expresión de moléculas de adhesión por parte de la célula endotelial, tales como selectina-E, VCAM-1 e ICAM-1, lo cual conlleva a un marcado incremento en la adhesión del monocito con la consiguiente propensión trombogénica67.

2.6. Plaquetas

En la activación plaquetaria hay degranulación e incorporación de las membranas lisosomales y granulares (con sus antígenos) en la membrana superficial donde estos son expuestos. De esta manera dichos antígenos pueden ser detectados por anticuerpos específicos; estos antígenos incluyen el antígeno CD62p (también conocido como P-selectina), que es una proteína de los gránulos-a de las plaquetas en reposo, y el antígeno CD63 que se encuentra en los gránulos densos y en las membranas lisosomales68.

Algunos estudios han sugerido que los aPL pueden intensificar la activación/agregación plaquetaria inducida por la trombina. Otros han encontrado un incremento de la agregación plaquetaria en pacientes LAC positivos; lo anterior sugiere que las plaquetas circularían en un elevado estado de activación en los pacientes con SAF69-70.

Estudios recientes por citometría de flujo han examinado la activación plaquetaria en pacientes con SAF primario. Joseph investigó la expresión de los marcadores de activación plaquetaria CD62p y CD63 en 20 pacientes, donde también se analizaron los niveles de P-selectina soluble como un posible marcador adicional de activación y se midieron los niveles de plaquetas reticuladas (con el fin de detectar cualquier posible incremento en el recambio) como indicador de vida media disminuida. La mayoría de los pacientes estaban recibiendo aspirina y/o warfarina y de esta forma se evaluó el efecto de la terapia en la activación plaquetaria71. Los resultados mostraron un aumento en la expresión de CD63 en los pacientes con SAF en forma estadísticamente significativa cuando se comparó con el grupo control (14.3% y 10.1% respectivamente; p: 0.0008). No hubo diferencia significativa en los niveles de CD62p o en los niveles de plaquetas reticuladas entre los dos grupos. Los pacientes que recibían aspirina tuvieron valores promedio menores de CD63 que los que no la recibían (13.1% y 18%; p: 0.023), no obstante el tratamiento con aspirina no previno significativamente la activación plaquetaria que ocurrió en algunos pacientes. Los valores promedio de P-selectina fueron mayores en los pacientes que en el grupo control; esto último pudiera explicar el porque se mantuvo normal la expresión de CD62p ya que la activación conllevaría a su liberación en la circulación. Todo lo anterior permite sugerir que hay cierta activación plaquetaria en algunos pacientes con SAF primario la cual no siempre era suprimida con el tratamiento con aspirina.