Apoptosis y Autoinmunidad

Mauricio Rojas López, Ph D
Universidad de Antioquia

Apoptosis (a.)

La célula tiene diferentes y extensos mecanismos que le permiten, ex profeso, escapar del daño inducido por elementos internos o externos conduciéndole a su propia muerte. Este fenómeno ha recibido la denominación de muerte celular programada o a.(1). Aunque la a. y la muerte celular programada se han tomado como sinónimos, en el sentido estricto la muerte celular programada sólo ocurre en células que están destinadas a ello (vgr, durante la embriogénesis y la atresia folicular) y la a. puede tomar lugar en cualquier célula expuesta a un estímulo que active la maquinaria de la muerte. Hecha esta salvedad, y contrastándola con la necrosis, la forma de muerte mediada por daño físico, consideremos que durante la a. el daño celular involucra diferentes estadios que no necesariamente se suceden y que confieren a la a. un patrón distinguible de la necrosis.

Estas características incluyen la pérdida de las uniones intercelulares, el detrimento de la permeabilidad selectiva de la membrana citoplásmica, la activación de bombas de iones como el calcio, el sodio y el potasio, la disminución del espacio intracelular que puede ser seguido por la condensación de la cromatina y la coalescencia del núcleo en varias masas que anticipan la fragmentación celular. Paralelamente hay degradación de organelas; sin embargo la mitocondria, cuyas precoces alteraciones alboran la muerte, puede permanecer funcionalmente activa casi hasta el final del proceso.

El retículo endoplásmico se transforma en vesículas que se fusionan con la membrana citoplásmica acelerando la exocitosis y la pérdida de volumen celular. La célula se escinde en corpúsculos que varían en tamaño y que, por la asimetría de la membrana citoplásmica debida a la lipoxigenación, exponen residuos de fosfatidilserina que pueden ser reconocidos por los macrófagos circundantes, lo que permite su remoción del medio sin generar inflamación. Finalmente, y en muchos casos, se da la activación de enzimas que degradan membranas, proteínas, ARN y ADN acelerando la desintegración celular.

La a. es un proceso, altamente regulado y complejo, involucra distintos niveles de modulación de factores de crecimiento, citoquinas y hormonas y requiere la actividad de la propia célula, así, ésta puede ser bloqueada por agentes que inhiben la síntesis de macromoléculas (como la ciclohexamida o actinomicina D), o puede involucrar vías independientes de la síntesis proteica induciendo el suicidio mediante moléculas preexistentes como las proteasas agrupadas en las familias de las Caspasas y las Calpainas.

Otros mediadores del daño son los reactivos intermediarios del oxígeno, (ROIs) que, junto con metales alcalinos, generalmente son los mediadores del daño mitocondrial. De los ROIs existen varias especies altamente activas y con ponderada capacidad oxidativa sobre proteínas, lípidos y DNA. Estas pueden reaccionar con el óxido nítrico que ha sido invoucrado tanto en la modulación positiva como negativa de la a.

A. en el sistema inmune

La expresión constitutiva de un vasto número de genes involucrados en la a. y la existencia de múltiples vías de señalización que pueden emprender la muerte celular, detenta importantes implicaciones para el organismo. La a. no es un fenómeno aislado, por el contrario, es una compleja y redundante manifestación de la actividad celular que aboga por la subsistencia del mismo. La idea de afianzar la muerte por una o varias vías pone mayor relieve en la multiplicidad de su significado biológico.

Por otro lado, los mecanismos de supervivencia celular no son menores ni menos complejos. Todos ellos deben armonizar en un sutil equilibrio que permite al organismo emprender una adecuada respuesta a los cambios del ambiente, es decir, la homeostasis. Centrándonos en el sistema inmune, vgr, la gran mayoría de los linfocitos T y B en circulación se encuentran en un estado de reposo y pueden tener una vida relativamente corta entre semanas y meses sino obtienen información de su medio como el estroma donde recibirán las señales de supervivencia.

De las células que son activadas por antígenos propios o foráneos son pocas las que escapan a la muerte, pues ante el contacto con el antígeno para el que han desarrollado especificidad se puede iniciar la a. Este fenómeno es gobernado por la avidez diferencial hacia el antígeno en el contexto del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), que puede llevar tanto al estado de anergia (ausencia respuesta) como a la a., dependiendo de sí los linfocitos (las células con especificidad por el antígeno) reciben en forma completa y adecuada las señales de activación y proliferación.

Durante este evento los linfocitos pueden sufrir a. así como la pueden sufrir por agentes inmunosupresores. La estrategia de eliminar las células demasiado ávidas por el antígeno, así como las células autoreactivas servirá ulteriormente al sistema inmune en su propósito de discriminar entre los antígenos propios y no, y habilitará los mecanismos de defensa circunscritos contra los microorganismos invasores.

Defectos en la modulación de la a. de las células autorreactivas pueden ser la causa de autoinmunidad: Mutaciones en Fas/FasL, granzimas, perforinas, alteraciones en Bcl-2 o las proteínas pertenecientes a esta familia; las variantes polimórficas de p53, el c-myc, el inhibitorio del receptor de IL-1a, los receptores de la muerte DR han sido estudiados en el contexto de la autoinmunidad, no obstante el sistema más divulgado y estudiado es el asociado con la vía de señales Fas/FasL.

TNF, Fas/FasL.

La familia de proteínas del factor de necrosis tumoral tanto secretadas como ancladas a la membrana incluye: TNFa, TNFb (o linfotoxina a), LT-b, FasL, CD40L. Estas son moléculas pleiotrópicas que juegan papeles críticos en la patogénesis de muchas enfermedades como principales moduladores de la a., la lisis necrótica y, paradójicamente, la sobrevida celular(2, 3), indicando la complejidad de los efectos mediados por estas moléculas. Los efectos del TNFa están mediados a través de diferentes receptores, el TNFR1 (p55) y el TNFR2 (p75). Éstos pertenecen a la creciente familia de receptores conocida como TNF/NGF-R e incluye: LT-bR (TNFR3, TNFRrP), Fas (CD95/Apo1), CD40, CD30, CD27, p75-NGFR, OX-40, 4-1BB (el receptor para herpes virus simple 3) y los dominios de muerte de los receptores 3 de muerte (DR3).

La unión de homotrímeros del TNFa y el FasL, liberados proteolíticamente de la membrana celular por la acción de las metaloproteinasas, a sus respectivos receptores inicia señales de transducción mediadas por el reclutamiento de diferentes proteínas que se van asociando sucesivamente con los dominios citoplásmicos de los receptores. Las proteínas que se asocian con el TNFR1 y el Fas pueden activar la a. a través de una trayectoria que es independiente de la síntesis de proteínas, y mediada por proteasas con homología a la enzima convertidora de la IL-1b (ICE o caspasas).

Alternativamente, el TNFR1 y el TNFR2 pueden iniciar una cascada dependiente de la síntesis de proteínas y de la translocación nuclear del NF-kB y que provee resistencia contra la a. Aunque hay demasiadas excepciones, en general se acepta que el TNFa media efectos ambivalentes dependiendo del receptor que transduzca señales y como consenso se considera que el TNFR1 media la a. mientras que el TNFR2 la activación del NF-kB, no obstante ambos pueden participar en la inducción de a. y los factores asociados con ambos receptores pueden participar en la activación del NF-kB. Para revisión, ver referencia 3.

Factores asociados a TNFR1 y Fas activan las proteasas de la muerte.

La unión del TNFR1 o el Fas por el TNFa o el FasL, respectivamente, induce el reclutamiento de diferentes proteínas sobre la cola citoplásmica a través de motivos llamados dominios de muerte, que en el TNFR1 comprenden alrededor de 80 residuos de aminoácidos esenciales para la a., la actividad anti-viral, y la inducción de la óxido nítrico sintasa. Éstos han sido encontrados en la cola citoplásmica de Fas, aunque no cumpla exactamente con las mismas funciones de TNFR1, transducen señales hacia el interior de la célula a través de los TRADD, FADD/MORT1 y RIP (proteína interactuante de receptor).

Los TRADD (dominios de muerte asociados a TNFR) se encontraron primero en asociación con el TNFR1, mientras que los FADD (dominios de muerte asociados a Fas) y RIP fueron identificados por su asociación con Fas. Estas tres moléculas forman una familia conocida como la familia: proteínas transductoras de señales conteniendo dominios de muerte.

La búsqueda de un factor específico capaz de asociar los dominios de muerte con la activación de proteasas, proteínas responsables del ataque proteolítico durante la acometida de la a., llevó identificar a FLICE (FADD-like ICE) y MACH (homólogo de CED-3 asociado a MORT1), los que corresponden a la actual Caspasa 8. Se observó que Caspasa 8 tiende dos tándem de dominios efectores de muerte, homólogos a FADD, y localizados sobre su porción amino terminal.

Además, la porción carboxilo terminal tenía homología con las cisteina proteasas y, en efecto, la misma actividad. Se sospechaba que Caspasa 8 era el factor operante después del reclutamiento de FADD/MORT1. Su sobreexpresión inducía a. inhibida tanto por el crmA (proteína del virus de la viruela, inhibitoria de serpina proteasas) como por el tripéptido z-Val-Ala-Asp y requiere la escisión proteolítica para ser completamente activado, pero la enzima responsable de ésto no había sido identificada hasta este punto.

Estudios en el modelo de C. elegans han permitido el descubrimiento de diferentes productos génicos que regulan el proceso de muerte. El secuenciamiento y el clonación del gen ced-3, que codifica otra cisteina proteasa, reveló su homología con ICE. Durante largo tiempo, ICE había sido únicamente asociado con la conversión de pro-IL-1b en su forma activa mediante una escisión alrededor de los residuos que siguen al ácido aspártico. Sin embargo, el hecho de que el cmrA viral inhibiera la a. mediada por ICE y FADD/MORT1 sugirió que FADD/MORT1 debería actuar en una vía similar a ICE.

Trabajos posteriores, usando la estrategia de la hibridación cruzada con el cDNA de ICE y diferentes búsquedas en bases de datos de genoma humano, permitieron la identificación de alrededor de 11 diferentes proteasas con homología estructural al ICE. Así, los candidatos putativos para la arremetida apoptótica, las proteasas relacionadas con ICE (IRPs), fueron clonadas(4-8). Sin embargo, el número exacto de enzimas involucradas, sus substratos endógenos y especificidades de cada una de ellas, además de sus cometidos particulares en los cambios bioquímicos y morfológicos durante la a. son por completo desconocidos.

Usando IRPs recombinantes en un sistema no celular para ensayos de inhibición de la a.(4-8) y haciendo comparaciones entre diferentes especificidades de los substratos, los IRPs fueron divididos y clasificados en tres subfamilias: 1) tipo ICE, que reconoce la secuencia Tyr-Val-Ala-Asp (YVAD); 2) caspasa 3 (tipo CPP32/Yama/apopapaina) que reconoce Asp-Glu-Val-Asp (DEVD) y 3) caspasa 6 (Mch2, proteasas tipo Ich) que reconocen la secuencia Val-Glu-Ile-Asp (VEID).

Como se mencionó anteriormente, aunque varios substratos celulares han sido identificados y éstos pueden ser redundantes, no se sabe si cada uno de los miembros de esta familia tiene alguna especificidad celular. Éstas pueden regularse alostericamente, escindir proteolíticamente a otras caspasas y los llamados substratos de la muerte que son elementos estructurales y de señalización críticos para la supervivencia celular, que incluyen: Laminas, poli(ADP-ribosa) polimerasa (PARP), DNA-proteína kinasas (DNA-PK), endonucleasas, proteína enlazante del elemento regulador del esterol (SREBP-1), la proteína de retinoblastoma y la pequeña ribonucleoproteína nuclear U1 (U1RNP).

Hallazgos recientes indican que la caspasa 8 es uno de los substratos de la caspasa 1(2), y se considera crítica para la a. inducida por el TNFa o el FasL. Esta observación está basada en el hecho de que fibroblastos derivados de embriones homocigóticos para una mutación nula en el gen de la Caspasa 8, no sufren a. mediada por TNFR, Fas o DR3, aunque presentan actividad kinasa en la porción amino-terminal del c-Jun (JNK) y son capaces de inducir la fosforilación del IkB y su posterior degradación.

Granzimas

Los linfocitos citotóxicos comprenden dos poblaciones de células efectoras con la habilidad de eliminar células autoreactivas, infectadas, y senescentes. Las células T citotóxicas (CTLs a/b) tienen tanto la especificidad como la memoria de reconocer las células blanco que presentan los oligopéptidos dentro del surco de las moléculas MHC. En contraste, las células asesinas naturales (NK) y macrófagos son mediadoras de la inmunidad innata contra las células infectadas por virus y neoplásicamente transformadas, no requieren presentación antigénica.

Ambos tipos de células utilizan proteínas formadoras de poros (perforinas) y una batería de enzimas serina-proteasas como principal medio para infligir sinergísticamente a las células blanco mediante la inducción de a. Cuando una célula citotóxica enlaza la superficie de sus células blanco, hay una reordenamiento en el aparato de Golgi y toma lugar la exocitosis de los gránulos hacia las células blanco (revisar referencias 8 y 9). Aunque se pensaba que la granzima B representaba una vía completamente independiente de inducir la muerte celular, se ha establecido que efectivamente ésta es una proteasa del tipo ICE.

La granzima B es capaz de escindir la pro-caspasa 10. Una vez la caspasa 10 es activada se cree que actúa sobre la pro-caspasa 3, y caspasa 3 sobre pro-caspasa 7 induciendo la activación de las caspasas 4, 5, 6 y 9. Estos cambios son secundarios a la activación inapropiada de la proteína kinasa p34cdc2, la cuál se transloca desde el citoplasma hasta el núcleo controlando la entrada de las células a la mitosis, es decir que las perforinas y las serina-proteasas pueden ejercer sus acciones a través de un desarreglo en la entrada a la fase G2 y la mitosis.

Autoinmunidad (10-13)

El sistema Fas y FasL involucra la a. durante la maduración de los linfocitos T. Los precursores de estas células se originan en la médula ósea y emigran hacia el timo, donde completan el repertorio CD4+CD8- o CD4-CD8+. En los diferentes estadios requeridos para alcanzar la maduración, tanto los precursores como los intermediarios sufren muerte celular programada.

Los precursores de células T que expresan un receptor de células T (TRC) que puede interactuar con el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) expresado sobre el epitelio del timo son seleccionados positivamente, los que no mueren también por a. De otro lado, los precursores que interactúan con gran avidez con el MHC del epitelio tímico también sufren a. en el proceso de selección negativa. Mas del 95% de los precursores que han arribado al del timo mueren, y sólo un 5% de estas células sale a la periferia como linfocitos T maduros.

En el caso del CD95/Fas/Apo-1 así como de su ligando FasL, se han descrito independientemente tres mutaciones que han dado origen a tres cepas diferentes de ratones. Todos estos tres tipos de ratones desarrollan linfoadenopatías masivas y una enfermedad lupoide. Dos de las mutaciones se encuentran en el CD95 (FasR), pero se presentan en cepas de diferente acervo genético: C57/BL/6 y CBA.

La mutación en los C57/BL/6 identificada como lpr/lpr (MLR) acelera el lupus, los ratones no viven más de seis meses y puede ser agravada por la sobreexpresión de Bcl-2. La otra cepa con mutación en CD95, CBA lprcg/ lprcg así como la cepa con mutación en FasL (CH3 gld/gld) no presentan la forma acelerada de lupus, dando relieve sobre la influencia del acervo genético en este mismo fenómeno. Adicional a estas cepas otra caracterizada funcionalmente por producción de anticuerpos contra glóbulos rojos, los linfocitos y el DNA de cadena simple es la NZB (New Zealand Black).

No obstante en relación con el fenómeno de regulación de la a., las cepas mejor caracterizadas son la C57/BL/6 lpr/lpr (MLR) y la CH3 gld/gld. El defecto de los ratones lpr es debido a una inserción de un elemento retroviral transponible dentro del segundo intrón del gen Fas. Esta inserción causa una terminación prematura de su transcripcción, así como una edición aberrante de este mRNA, resultando tanto en una marcada reducción de la expresión superficial del Fas(10).

Aunque se ha detectado la expresión de mRNA y superficial de Fas, su funcionalidad aun no ha sido demostrada. En el caso de los ratones CH3 gld/gld el defecto resulta de una mutación puntual en la porción que codifica carboxilo terminal del FasL, y los cuáles carecen de FasL funcional. Tanto los lpr como los gld son considerablemente resistentes a la inducción de a. mediante varios estímulos, incluida la radiación g.

Aunque en el caso de los ratones lpr y gld el consenso indica que los procesos de selección tímica son normales, la selección periférica no lo es, pues estas células no sufren a. durante la activación antigénica. Basados en estas observaciones, se ha propuesto como modelo que las células presentadoras de antígeno expresan los péptidos propios (autoreactivos) en su MHC. El complejo péptido-MHC interactúa con el TRC del linfocito autoreactivo, lo cual induce la expresión de Fas y FasL en los linfocitos, pudiendo éstos ser eliminados por a.; lo que no ocurre en los lpr o gld.

El sistema Fas/FasL también juega un importante papel en la actividad de las CTLs. Ratones deficientes en el gen que codifica para la perforina muestran una citotoxicidad deficiente hacia las células que no expresan Fas. Ésto sugiere que las perforinas y el FasL podrían ser las moléculas efectoras mediante las cuales se remueven células autorreactivas. Ha sido demostrado que las CTLs inducen la muerte de sus células blanco mediante un sistema de doble reconocimiento: MHC y Fas/FasL.

La unión FasL y Fas induce la liberación de la perforina que inestabiliza la membrana de la célula blanco, permitiendo la entrada de las granzimas que serán las proteasas encargadas de activar su propio suicidio. No obstante, las células que presentan sobre-expresión del proto-oncogen Bcl-2 (líneas murinas de mastocitoma y esplenocitos activados con concanavalin A) son refractarias a la actividad de las CTLs aloespecíficas y per se pueden suprimir la actividad inducida por el Fas/FasL independiente de granzimas. Aunque estos datos sugieren que Bcl-2 podría interferir como mediador común de ambas vías, ésto aún no se ha demostrado. De otro lado, aunque Bcl-2 puede proteger de los efectos pro-apoptóticos del Fas y las granzimas, no previene los efectos líticos de las perforinas sobre la membrana.

Blancos prospecto de a.

Se ha considerado que las caspasas serían las responsables de generar las “entidades antigénicas de novo”, pues al degradarse los substratos de muerte se producen fragmentos distintos a los que se producen normalmente en el protesoma e iniciar una respuesta inmune dirigida contra ellos. Debido a que la a. toma lugar durante toda la vida del individuo, es de esperarse que las células autoreactivas que reconocen los subtratos de la muerte debieron haber sido eliminadas o inducidas al estado de anergia. Sin embargo, la existencia de autoanticuerpos contra los substratos de la muerte y otros elementos nucleares sugiere que probablemente los cuerpos apoptotóticos no son adecuadamente removidos.

Durante los últimos años se ha acumulado la suficiente evidencia experimental en cuanto al papel que tiene la a. en la resolución de la respuesta inflamatoria aguda. La a., a diferencia de la necrosis, evita el vaciamiento del contenido celular siempre y cuando los cuerpos apoptotícos sean adecuadamente removidos por células fagocíticas utilizando diferentes receptores(14): vitronectina, fosfatidil serina, CD16, CD36, el receptor scavenger.

Hasta el momento estos receptores han sido parcialmente identificados, nada se conoce de su posible asociación con las enfermedades autoinmunes. Finalmente, es interesante notar que todas formas la autoinmunidad podrían estar intimamente asociadas con alteraciones en la regulación de la a., incluida la capacidad de remoción de las células pre-apoptóticas que sólo hasta ahora comienza a tener algún auge.

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