Articulo de investigacion: Estudio de Variantes Moleculares de los Genes PTPN22, TNF Y VDR en Madres de Niños con Nefritis Lúpica

Asociación como Factores de Riesgo

Gloria Garavito de Egea1, Eduardo A. Egea Bermejo2, Clara Malagón3, Luis Fang Mercado4, Carlos Olmos5, Luz González6, Pilar Guarnizo7, Fernando R. De la Cruz López8, Gustavo Aroca9, Guillermo López Lluch10, Antonio Iglesias11

Resumen

La Nefritis Lúpica (NL) es más frecuente en mujeres. Se reconoce que madres con Lupus Eritematoso Sistémico (LES) confi eren mayor riesgo al desarrollo de esta entidad en sus hijos. Esta transmisión se debe a la impronta genómica y/o al genotipo materno sobre el desarrollo prenatal. En este estudio se identifi caron variantes de los sistemas PTPN22, VDR y TNF, asociadas a NL pediátrica (NLp). Se investigó la asociación de marcadores en 64 familias: 46 tríos (Caso/Padre- Madre) y 18 dúos (Caso/Madre). Se genotipifi caron los SNPs rs2476601 [A/G] de PTPN22; rs361525 [A/G] y rs1800629 [A/G] de TNF; TaqI [rs731236 A/G], ApaI [rs7975232 A/C], BsmI [rs1544410 C/T] y FokI [rs2228570 A/G] de VDR mediante RT-PCR. Se estimó el efecto de la sobretransmisión del alelo de riesgo de padres a hijos. Se estimó el efecto genético de los SNPs sobre los niños (R1 y R2) y también se estudiaron la infl uencia genética materna (S1 y S2) y la impronta materna (Im). Se observó que el alelo A de rs2476601 en PTPN22 es sobretransmitido (p=0,028) en los niños con nefritis lúpica y se demostró que los niños portadores de una copia del alelo A de rs2476601 presentan un riesgo (R1) de 0,20, mientras que dos copias del alelo (R2) lo incrementan a 1,71. Además, si la madre es portadora de dos copias del alelo A (S2), el riesgo aumenta a 2,5. La impronta genética fue de 0,97 (p=0,002). Nuestro estudio describe la infl uencia materna de las variantes de PTPN22, TNF y VDR sobre niños con NLp en familias colombianas.

Palabras clave: Lupus eritematoso sistémico, Nefritis Lúpica, Epigenética, Impronta genómica, Modelos Genéticos.

Maternal Genetic Variants in Ptpn22, Tnf And Vdr and the Risk of Pediatric Lupus Nephritis

Abstract

Lupus nephritis (LN) is more common in women. It is recognized that mothers with SLE confer increased risk to develop this entity to their children. This transmission is due the genomic imprint and/or maternal genotype on prenatal development. In this study, variants of PTPN22, TNF and VDR genes were identifi ed and associated with pediatric LN (PLN). The association of markers was investigated in 64 families: 46 trios (case/Father-Mother) and 18 duos (case/ Mother). The SNPs rs2476601 [A/G] of PTPN22; the rs361525 [A/G], rs1800629 [A/G] from TNF and TaqI [rs731236 A/G], ApaI [rs7975232 A/C], BsmI [rs1544410 C/T] and FokI [rs2228570 A/G] of VDR gene were genotyped by RT-PCR. The effect of over-risk allele transmission from parents to children was estimated. The genetic effect of the SNPs on children (R1 and R2) was estimated and maternal genetic infl uence (S1 and S2) and maternal imprinting (Im). It was observed that the A allele of rs2476601 in PTPN22 is over-transmitted (p = 0,028) to PLN children, and that children carrying one copy of the allele of rs2476601 have a (R1) risk of 0,20; while two copies of allele (R2) increase it to 1,71. Also, if the mother carries two co- pies of allele A (S2), the risk become 2,5. DNA fi ngerprinting was 0,97 (p = 0,002). Our study describes maternal infl uence of the variants of PTPN22, TNF and VDR genes on children with PLN in colombian families.

Key words: Systemic Lupus Erythematosus, Lupus Nephritis, Epigenetic Genomic Imprinting, Genetic Models.

Introducción

El Lupus Eritematoso Sistémico (LES) es una enfermedad autoinmune compleja, caracterizada por la producción de autoanticuerpos contra moléculas nucleares, citoplasmáticas y de la superfi cie celular de quien la padece (1-3). Sus manifesta-ciones comprenden una amplia gama de signos y síntomas clínicos como erupciones cutáneas, fotosensibilidad, úlceras orales, artritis, pleuritis, pericarditis, nefropatías y convulsiones (4). Se desconocen las causas de LES; sin embargo, se ha demostrado su vínculo con factores genéticos y ambientales (5-7).

Por su parte la nefritis lúpica (NL) es un en- dotipo de LES que afecta a tres de cada 100.000 personas (8). Previamente se ha demostrado la asociación de variantes genéticas presentes en los genes de PTPN22, VDR, TNF y HLA en adultos con endotipo de Nefritis Lúpica tipo IV (NL IV); así como la aparición a temprana edad de Nefritis Lúpica Pediátrica (NLP). Como se ha descrito en la literatura, esta enfermedad autoinmune ha demostrado un comportamiento sexodependiente, donde el género femenino presenta 2,6 (95%IC: 1,38 – 4,91) y 2,73 (95%IC: 1,22 – 6,11) veces más probabilidad de padecer NLP y NL IV, respectivamente en poblaciones de la región caribe colombiana.

La evidencia confirma que LES afecta predominantemente a las mujeres más que a los hombres, en una proporción de 6-10, especialmente a temprana edad (9,10). Además, se ha descrito que madres con diagnóstico de LES confieren mayor riesgo al desarrollo de la enfermedad en sus hijos que los padres (11,12). Aunque algunos reportes en la literatura no demuestran coherencia en los resultados, en la mayoría de los casos por las diferencias entre las poblaciones estudiadas es probable que el abordaje del estudio genético sea insuficiente para responder interrogantes sobre el desarrollo de la misma (13,14). Los estudios de asociación de casos y controles son una alternativa ampliamente usada para la identificación de factores genéticos de riesgo sobre una enfermedad en particular (15, 16). Sin embargo, este enfoque metodológico ignora mecanismos adicionales que influyen sobre la enfermedad. Las bases moleculares de esta transmisión preferencialmente materna de riesgo de LES son actualmente desconocidas, pero se puede responder mediante dos mecanismos biológicos: la impronta genómica y el efecto directo de genotipo materno (11,17).

En la impronta genómica el alelo heredado (ya sea del padre o de la madre) se expresa, mientras que el alelo alterno es silenciado. Así el efecto de un alelo dependerá de su origen (padre o madre) resultando con diferencias fenotípicas entre los heterocigotos con translocaciones recíprocas (efecto de origen paterno o materno) (18). Recientemente se ha demostrado que los efectos de origen paterno en enfermedades complejas se deben a variaciones genéticas en los genes impresos (19). Por su parte los efectos de genotipo materno ocurren cuando el genotipo materno influye directamente sobre el fenotipo de la descendencia. Este efecto es completamente independiente del genotipo propio de la descendencia y ocurre a través del ambiente proporcionado por la madre durante el desarrollo prenatal. El efecto del genotipo materno puede conllevar diferencias fenotípicas entre heterocigotos recíprocos, considerándose de este modo como efectos de origen parental específico (17, 20).

Nuestra pregunta científica se orientó a determinar si las variantes genéticas en los loci PTPN22, VDR y TNF pueden dar respuesta al comportamiento génerodependiente que se observa en LES a partir de la impronta genómica y efectos de origen materno. Para esto se realizó un estudio de tríos (Caso/Padre- Madre) y dúos (Caso/Madre), en donde el caso índice correspondió a un niño(a) con diagnóstico clínico y anatomopatológico de Nefritis Lúpica Pediátrica.

Métodos

Población de estudio

Se realizó un estudio analítico para determinar la asociación de polimorfismo tipo SNPs de tres sistemas genéticos: PTPN22, TNF y VDR en una cohorte de 64 familias colombianas: 46 de ellas fueron tríos (Caso/Padre-Madre) y 18 dúos (Caso/ Madre) para un total de 174 individuos en los cuales se identificaron marcadores de impronta genómica materna. En este estudio solo se incluyeron familias cuyos padres (papá/mamá) no refirieron antecedentes personales de enfermedades autoinmunes. A todos los participantes se les tomaron muestras de sangre periférica para la extracción de ADN genómico, previo asentimiento y consentimiento informado por parte del menor de edad y el padre o tutor legal respectivamente. El presente estudio contó con aprobación del Comité de Ética de la Universidad del Norte.

Genotipificación de SNPs

El ADN genómico se extrajo a partir de leucocitos de sangre periférica mediante la técnica de Salting-out (21). Se genotipificaron los SNPs rs2476601 [A/G] en el gen de la Proteína Tirosina Fosfatasa no Receptora Tipo 22 (PTPN22); rs1800629 [A/G] y rs361525 [A/G] del gen del Factor de Necrosis Tumoral alfa (TNF-α); y los polimorfismos TaqI [rs731236 A/G], ApaI [rs7975232 A/C], BsmI [rs1544410 C/T] y FokI [rs2228570 A/G] presentes en el gen del receptor de vitamina D (VDR). Estos SNPs se estimaron mediante PCR en tiempo real (RT-PCR) utilizando estuches disponibles comercialmente TaqMan® SNP Genotyping [Assay ID: C__16021387_20, C___7514879_10, C___2215707_10, C___2404008_10; C__28977635_10; C__12060045_20 y C___8716062_10; respectivamente] de la casa Applied Biosystems, Foster City, CA, USA.

Los ensayos de genotipificación se realizaron en un equipo de RT-PCR ABI Prism 7300, de Applied Biosystems con un volumen total por reacción de 5μL (2.4μL de DNA a una concentración aproximada de 10ng/μL, 2.5μL de Master Mix-2x y 0.125μL de sondas Taqman Genotyping-40x específicas de cada SNP). Todas las reacciones de PCR se realizaron por duplicado. El programa de ciclado consistió de un paso inicial de 10 minutos a 95°C, seguido por 40 ciclos de 15 segundos a 92°C y 1 minuto a 60°C por ciclo. La asignación genotípica se realizó automáticamente mediante la aplicación de Allelic Discrimination del sistema Applied Biosystems, la cual tuvo en cuenta una calidad de amplificación ≥90% por muestra.

Análisis estadístico

El análisis estadístico consistió en determinar las frecuencias alélicas y genotípicas mediante el software estadístico SPSS v20 (IBM® SPSS® Statistics 20; IBM Corp., USA). A estas frecuencias se les estimó la desviación del equilibrio de Hardy-Weinberg y se compararon entre los padres y descendientes usando el Test de diferenciación de muestras de Arlequin v3.5.

La segregación de los SNPs de PTPN22, VDR y TNF entre los Tríos, se realizó mediante el cálculo de los estadísticos de desequilibrio de ligamiento (LD) como son el D´ y el r2, así como la estimación de los alelos de riesgo para cada SNP que eventualmente se sobretransmite de padres a hijos; para estos análisis se empleó el software Haploview 4.1. En el análisis de familias también se estimó el efecto genético de los SNPs de PTPN22, VDR y TNF sobre los niños (R1 y R2), el efecto genético materno (S1 y S2) y la impronta materna (Im) teniendo en cuenta todas las familias mediante las herramientas de análisis genético PREMIM-EMIM (22, 23). Estos fenómenos se estimaron a partir de modelos de probabilidad multinomial, asumiendo que los padres del estudio se encuentran en equilibrio genético de Hardy-Weinberg y existe apareamiento aleatorio en esta. La probabilidad de riesgo de la enfermedad en los niños en caso de presentar una copia del alelo de riesgo se representa como “R1” y si presenta dos copias del alelo de riesgo se representa como “R2”, el efecto materno es representado como “S1” (si la madre porta una copia del alelo de riesgo) y “S2” (si la madre porta dos copias del alelo de riesgo); la impronta genética es descrita como “Im”; todos estos parámetros fueron estimados en un modelo genético. La significancia estadística fue interpretada como p<0,05.


1 MD-Ph.D, Universidad del Norte, División Ciencias De la Salud, Grupo de Investigación en inmunología y Biología Molecular, Barranquilla-Colombia. 2 MD-Ph.D, Universidad del Norte, División Ciencias De la Salud, Grupo de Investigación en inmunología y Biología Molecular, Barranquilla-Colombia. 3 MD-Especialista, Universidad del Bosque, Ciencias de la Salud, Bogotá-Colombia. 4 MSc, Corporación Universitaria Rafael Núñez. Universidad de Cartagena. Cartagena-Colombia. 5 MD-Especialista, Universidad del Rosario, Ciencias de la Salud, Bogotá –Colombia. 6 MD-Especialista, Universidad del Bosque, Ciencias de la Salud, Bogotá-Colombia. 7 MD-Especialista, Universidad del Rosario, Ciencias de la Salud, Bogotá –Colombia. 8 B.Sc(C), Universidad del Norte, División Ciencias de la Salud, Grupo de Investigación en inmunología y Biología Molecular, Barranquilla-Colombia. 9 MD-Especialista, Universidad Simón Bolívar, Ciencias de la Salud, Grupo de Investigación Nefrología, Barranquilla-Colombia. 10 B.Sc-Ph.D, Universidad Pablo de Olavide. Departamento de Fisiología, Anatomía y Biología Celular, Sevilla-España. 11 MD-Especialista, Universidad Nacional, Ciencias de la Salud, Grupo Unidad de Reumatología, Bogotá –Colombia.

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