Hallazgo de Trypanosoma Cruzi en Momiais de Mas de 4000 Años de Antiguedad

Doctores Carlos Jaramillo, Felipe Guhl, María Fernanda Gomez, Rossana Yockteng, Gustavo Vallejo.

Resumen

En este trabajo se reporta una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que permite la detección de Trypanosoma cruzi por medio del estudio directo de tejidos momificados humanos. Las muestras fueron tratadas para la extracción de ADN y luego sometidas a la prueba de PCR, basándose en la amplificación de la región variable de los minicírculos del ADN del cinetoplasto (kADN) de T cruzi.

Debido a la especificidad de los iniciadores y a la alta reproducibilidad de la prueba se pudo estudiar la presencia de kADN en tejidos de corazón, esófago e intestinos así como la concordancia de los patrones obtenidos con ADN de parásitos de cultivo de cepas Colombianas. De un total de 40 muestras de 26 momias, ADN extraído de 17 fragmentos de tejido (pertenecientes a 13 individuos) fue positivo para kADN específico de T cruzi, mientras que para los controles negativos no se obtuvo el producto esperado de 33Obp.

Introducción

La práctica de la momificación de cuerpos humanos en el nuevo mundo fue una característica muy común en la mayoría de las sociedades prehis-pánicas pertenecientes a diferentes grupos aborígenes que habitaron lo que hoy corresponde a países como Chile, Colombia, Argentina, Ecuador, Perú, Bolivia, algunas regiones de Meso América y el sur de Estados Unidos.

El estudio de restos humanos antiguos, no sólo permite conocer cómo murieron nuestros antepasados, sino también aporta información sobre las enfermedades que sufrieron y que en muchos casos siguen afectándonos, ayudando a desarrollar terapias para combatirlas. Dentro de la biología humana, la paleopatología estudia las enfermedades que padeció el hombre en el pasado, algunas de las cuales tuvieron carácter de endemia (presencia permanente en una zona). Muchas de estas dolencias como es el caso de la enfermedad de Chagas, la fiebre amarilla y el cólera, que al parecer causaron estragos en el pasado, mere-cen especial atención porque aún siguen siendo un problema importante de salud pública.

La incidencia de la enfermedad de Chagas es de cerca de 1 millón de casos por año y la mortalidad estimada arroja valores de unas 5.000 muertes por año.

Esta enfermedad se caracteriza por tener una fase inicial de infección, durante la cual hay pará-sitos circulando a través del flujo sanguíneo, además de replicación del parásito en células del miocardio, macrófagos, fibroblastos y células del sistema nervioso. Después de 8 a 10 semanas sigue la fase indeterminada en la cual disminuye la parasitemia debido a la respuesta inmune. Este período puede tener una duración de 10 a 20 años y generalmente es asintomático. Por ultimo en la fase crónica hay baja parasitemia y lesiones que incluyen cardiopatía crónica y alteraciones crónicas digestivas y neurológicas (2).

Distintos rasgos paleopatológicos como son megacolon, megaesófago y cardiopatías, encontrados por Rothhamer et al, 1985, en momias chilenas datadas de 470 B.C. hasta 600 A.D., fueron motivación suficiente para emprender el estudio de detección de ADN de T. cruzi en cuerpos con momificación espontánea. Hemos recuperado ADN de varios entierros de la cultura Chinchorro entre otras, lo que ha permitido el análisis basado en PCR de secuencias de ADN mitocondrial. El material genético fue obtenido a partir de tejido suave interno de 26 individuos. Este ensayo podrá ser aplicado en la detección de otros agentes infecciosos en tejidos momificados.

Enfermedad de Chagas en Sudamérica precolombina

Los estudios sobre condiciones osteopatológicas en momias han tenido un considerable desarrollo en la Antropología Física (3). Sin embargo, en los últimos tiempos, análisis en tejidos blandos han permitido conocer de alguna forma el estado de salud de las poblaciones precolombinas, diagnosticar causas de muerte con cierto grado de exactitud y describir patologías de enfermedades que han sido siempre un problema importante en la salud del hombre como es el caso de la enfermedad de Chagas, todo esto gracias a que nuevas técnicas de investigación y diagnóstico como la biología molecular han sido desarrolladas para que sean aplicables a materiales arqueológicos.

Los diferentes estudios en restos humanos han generado un gran potencial informativo que junto con datos históricos, complementan la información necesaria para la interpretación de nuestro pasado. De esta forma se pueden establecer vínculos más consistentes entre los datos fisiopatológicos y la naturaleza sociocultural del grupo observado para una reconstrucción mas acertada del poblamiento prehispánico (3).

La región de origen de las momias en estudio es el valle de Azapa, asiento de una extensa unidad poblacional con características regionales, a la que se le ha llamado cultura Chinchorro. Los Chinchorros fueron unos cazadores pescadores, que se establecieron en las regiones costeras del sur del Perú y norte de Chile, hace aproximadamente 9.000 años.

La movilidad de un lugar a otro jugó quizás un papel importante, debido a la economía de subsistencia. Esto sugiere la hipótesis de oleadas migracionales provenientes de los trópicos que, vía trasandina, llegaron hasta las zonas más áridas.

Climatológicamente esta zona es un lugar muy seco y árido, frecuentemente erosionado por el viento. Las condiciones de escasa humedad hicieron que el sector fuera considerado ideal para habitar, al estar lejos de charcos y ciénagas, habitadas por insectos transmisores de paludismo y otras enfermedades (4).
El término Chinchorro se refiere a una playa en Arica, Chile, donde el arqueólogo alemán Max Uhle, descubrió numerosos cuerpos de momias durante sus excavaciones en 1910. En 1919 Uhle realizó un estudio donde describía las momias de los aborígenes de Arica, dividiéndolas en tres grupos:

– Momias de tipo simple
– Momias de preparación complicada
– Momias cubiertas de barro

En este trabajo se contó con momias del primer tipo las cuales se caracterizan por no tener ninguna evidencia de tratamiento interno del cuerpo (Momificación natural). Hoy en día es usual encontrar momias de este tipo, que fueron secadas por el calor generado por el sol con todos sus órganos intactos debido solo a la falta de agua (5).

Iniciadores utilizados

Los dos sistemas más importantes recientemente utilizados en la amplificación de ADN son los minicírculos de los cinetoplastos y las secuencias satélites (6). Experimentos anteriores han sugerido que la amplificación de ADN de los minicírculos de los cinetoplastos es un muy buen método ya que es capaz de detectar la presencia de una sola célula de parásito en 20 ml de sangre (6).

Con el fin de contar con un método sensible y específico para la detección del parásito en muestras biológicas, se usaron 2 oligonucleótidos (S35-S36) con base en las regiones conservadas encontradas en los minicirculos de T. cruzi. Estos iniciadores tienen la siguiente secuencia:
S35
5′-AAATAATGTACGGGKGAGATGCATGA-3’y

S36
5′-GGTTCGATTGGGGTTGGTGTAATATA-3 –

Materiales y Metodos

Material de estudio

El material momificado fue provisto por el Dr. Arthur Aufderheide (Paleobiology Laboratory, University of Minessota, School of Medicine, Duluth, U.S.A.).

Las muestras fueron obtenidas de restos humanos provenientes del desierto de Atacama, Norte de Chile y Sur del Perú. Las condiciones áridas en esta región producen comúnmente momificación espontánea por una rápida desecación de los restos humanos enterrados.

Las momias usadas en este estudio fueron seleccionadas al azar dentro de las muestras enviadas por el Dr. Aufderheide. La antigüedad del material abarca desde 7500 años antes de nuestra era hasta tiempos coloniales.

Arqueológicamente pertenecían a 7 grupos culturales:

– La cultura Chinchorro data de 7500-2000 AC.
– La cultura Alto Ramírez data de 1000-350 AC.
– La cultura Cabuza data de 350-1000 DC.
– La cultura Maitas Chiribaya data de 900-1250 DC.
– La cultura Gentilar data de 1200-1350 DC.
– Colonial
– San Lorenzo
– Camarones-9

Se escogieron 26 de 29 individuos proporcionados y se trabajaron preferencialmente tejidos como corazón, esófago y colon.

El número de muestras analizadas fue 40, correspondiente a diferentes tejidos repartidos en los 26 individuos. El control negativo (tejido de momificación espontánea de adolescente del desierto de Egipto) incluye muestras de hígado, músculo y pulmón, mientras que del control positivo (Fornaciari) se analizaron muestras de los siguientes tejidos: recto, colon transverso, corazón y esófago.

Como un control positivo adicional se usó ADN de T cruzi de cultivo, cepa Y-Sousa.

Extracción de ADN

El ADN se extrajo mediante el método tradicional de fenol-cloroformo o mediante un kit comercial, siguiendo el protocolo indicado en el manual.

Amplificación de ADN de T. Cruzi

En cada reacción de amplificación de 20 l se usaron: Buffer 10X, MgCl2, KCl, dNTPs, S35 y S36, Taq Polimerasa y 2 l del ADN extraído. Para las reacciones de PCR se usó un termociclador MJ Research PTC-100 programado con el siguiente perfil térmico. 35 ciclos de 94C 1 minuto, 60C 1 minuto, 72C 1 minuto; una denaturación inicial de 5 minutos a 94C y una extensión final de 5 minutos a 72C. En todas las reacciones de amplificación se incluyeron controles positivos con ADN del parásito de cultivo y blanco de reacción (mezclas de reacción sin ADN).

Después de la amplificación, los productos de PCR obtenidos fueron visualizados por electroforesis en geles de agarosa al 2% y observados bajo luz ultravioleta, los productos de PCR una vez mezclados con el tampón de carga fueron sembrados en los diferentes pozos. Se conectó la cubeta a la fuente de poder y se seleccionó el voltaje (70V, constante). Una vez el ADN completó el recorrido, se tomó una fotografía del mismo.

Digitalización y análisis de imágenes

Para obtener un estimativo del tamaño molecular de las andas, se sirvieron en cada gel marcadores de peso molecular. De esta forma el peso de un fragmento de ADN se puede estimar comparando su movilidad con las de los estándares corridos en el mismo gel. La distancia de cada estándar de peso molecular es medida desde la parte superior del gel, obteniéndose así una curva de calibración. El peso molecular de la banda correspondiente al producto de PCR obtenido, se interpola después con base a su distancia de migración.

Una vez tomadas las fotos de los geles, se procedió a digitalizarlas con ayuda de un scanner. Las imágenes digitalizadas fueron analizadas con ayuda de un computador Macintosh Quadra 605 utilizando el programa NIH-Image.

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