Letras, ¿Porqué el Premio Nobel 1991? Erwin Neher y el “Patch Clamp”

Por el Profesor Antonio García y G.
(Con autorización especial del al/tor
y de la revista “Consulta” de España).

El profesor Erwin Neher es un científico alemán de cuarenta y cinco años que ideó la técnica conocida con las palabras inglesas “patch clamp”, que en castellano viene él significar “fijación de voltaje en parches de la membrana celular”.

A veces, una nueva metodología facilita el avance científico de forma vertiginosa. Tal es el caso del “patch clamp”, que en la última década ha permitido catalogar decenas de canales iónicos de decenas de células excitables y no excitables, y ha hecho posible el análisis exhaustivo de las propiedades cinéticas de su apertura y cierre, de su regulación por neurotransmisores y hormonas, así como la identificación de la subunidades peptídicas implicadas en la estructura y función de muchos de esos canales.

Recientemente, me comentaba un colega que los que nos dedicamos a este campo estamos encontrando en las células más canales que en Venecia.

Dejando aparte ese comentario irónico, lo cierto es que hoy contamos por decenas los subtipos de canales de potasio, se han identificado ya media docena de canales de calcio y se están descubriendo otros nuevos de cloro o de sodio.

Unos se activan e inactivan por cambios del potencial de membrana (los denominados canales voltaje-dependientes) y otros por neurotransmisores específicos (los llamados canales operados por receptores).

Esta variedad de canales abre múltiples caminos para el diseño de fármacos que modulen específicamente uno u otro canal y que, por consiguiente, tienen una notoria potencialidad terapéutica. ¿Cómo se llegó al descubrimiento de las técnicas de “patch clamp”? ¿Cual es su significado? (Lea: Letras, El Profesor Guillermo Uribe Cualla)

El Problema

Recuerdo cuando me encontraba perdido, física e intelectualmente, en medio de centenares de alumnos, escuchando al profesor Antonio Gallego sus explicaciones acerca del potencial de membrana y del potencial de acción de la neurona.

Corrían los mediados años sesenta por los inmensos anfiteatros semicirculares de la Facultad de Medicina de la Universidad Complutense. Don Antonio nos contaba los experimentos de Hodking, Huxley, Katz, Cale y Frankenhaeuser en el axón gigante del calamar.

Desde los años cincuenta, era imperativo recurrir a esta preparación, o a neuronas gigantes de caracol para poder estudiar los mecanismos básicos de la excitabilidad eléctrica. Para fijar el potencial de membrana había que introducir dos electrodos en el interior celular, lo que era posible sólo en estas células gigantes.

Durante decenas de años, los electrofisiólagos acariciaban la idea de poder estudiar las corrientes y los canales iónicos en neuronas y otras pequeñas células de mamíferos: pero dadas las dificultades técnicas, tuvieron que conformarse con hacer extrapolaciones de aquellas células primitivas a éstas.

En los años cincuenta- sesenta coincidieron en el “University College” de Londres un alemán (Bemard Katz), un espai101(José del Castillo) y un mejicano (Ricardo Miledi) quienes realizaron un análisis exhaustivo de la liberación de la acetilcolina en la placa motora , así como de las sei1ales eléctricas que ésta generaba al estim ular los receptores nicotínicos ubicados en la superficie de la fibra muscular esquelética.

Los regiegos de los cambios eléctricos observados por éstos y otros electrofisiólogos presentaban pequeñas oscilaciones que hicieron sospechar se trataba de aperturas y cierres de canales iónicos únicos. El reto de poder captar y analizar la diminuta corriente que fluía por uno solo de aquellos canales iónicos fue el motor para el descubrim iento de las técnicas de “patch clamp”.

La Técnica

Para registrar la corriente de un canal se necesitaba aislar eléctricamente un pequei10 parche de membrana. Para ello. Neher y Sakmann pulieron con calor la punta de una micropipeta de vidrio de 0.5 a 1 micrómetros de diámetro rellena de una solución salina. Al contactar con la limpia superficie de una célula aislada de músculo esquelético de rana, observaron que se formaba un sello entre la membrana celular y la punta de la pipeta.

Cuando intentaron por vez primera este experimento, Neher y Sakmann encontraron una grave dificultad técnica: el parche de membrana no estaba bien aislado de su entorno, por lo que la corriente que fluía a través de la pipeta se escapaba en parte, y no reflejaba toda la corriente generada en el parchecito de membrana comprendido en el circulito de la punta de la micropipeta. Sin embargo, fueron afortunados en la selección de la célula y del canal iónico.

La célula procedía de un músculo esquelético denervado de rana, cuyo número de receptores para acetilcolina está incrementado. Y el canal iónico era el asociado al receptor nicotínico de acetilcolina, que conduce una cantidad elevada de corriente. Por ello, a pesar de que el sello era laxo, pudieron obtener los primeros registros de corrientes a través de canales iónicos individuales, registros que vieron la luz en la revista “Nature”, en 1976.

Cinco ai10s después, los esfuerzos de Neher por mejorar la técnica se vieron compensados por dos innovaciones tan sim pies como espectaculares en sus resultados.

La firmeza del sello pipeta- membrana se mejoró en un factor de 100 a 1.000 veces utilizando una pipeta nueva, bien pulida y limpia para cada sello, y por la aplicación de una ligera succión a través de la pipeta una vez que su punta contacta la superficie celular. Así, un pequeño parche de la membrana se introduce en el interior de la punta de la micropipeta. formando una semivesícula en forma de omega.

De esta manera se instaura un sello firme, de altísima resistencia al paso de la corriente, quedando así el parche de membrana aislado eléctricamente del resto de la membrana celular y del medio extracelular. Este sello de resistencia elevada ha permitido el registro de corrientes en canales únicos en casi todos los sistemas celulares explorados; ello se debe a la drástica disminución del ruido de fondo que tanto perturbaba los registros de corrientes en los primitivos sellos más laxos.

Estas modificaciones técnicas se publicaron en 1981 en la revista alemana “Pfluger Archives of Physiology” figurando como coautores Neher, Ramill, Marty, Sakmann y Sigworth. Diez ai10s después, este trabajo es probablemente uno de los más citados en la literatura científica de todos los tiempos.

Posibilidades de la Técnica

Hasta la aparición de las técnicas de “patch clamp”, el registro de la actividad eléctrica de una célula podía hacerse sólo por expertos electrofisiólogos y en el número limitado de células de suficiente tamaño.

Hoy los equipos de “patch clamp” se ven en laboratorios de bioquímicos, farmacólogos y fisiólogos como si de una técnica más se tratara. ElWin Neher dotó a esos equipos de una elevada automatización, así como de programas de ordenador que permiten el análisis de los datos obtenidos por cualquier investigador medianamente familiarizado con la metodología.

Así, pues, el mérito de Neher no es solo la ideación de equipos y metodologías para estudiar la actividad de un sólo canal iónico, sino el haberlos “divulgado” para hacerlos asequibles a cualquier célula, por pequeña que ésta sea.

Otra ventaja de la técnica es el acceso directo al interior celular. Rompiendo mediante succión el parche de membrana, el interior de la pipeta se comunica con el interior celular. De esa manera pueden medirse corrientes globales en células tan pequeñas como eritrocitos y plaquetas, células cromafines, células adenohipofisarias y neuronas de varios tipos.

A través de la pipeta pueden introducirsen también sondas fluorescentes en la célula, o anticuerpos, péptidos, fármacos o enzimas cuyo mecanismo de acción sobre un determinado canal iónico se desea explorar. En suma, puede manipularse con facilidad la composición del medio intracelular.

Otra ingeniosa estrategia consiste en el estudio simultáneo de corrientes iónicas, de los cambios de la concentración de calcio citosólico y de la liberación de catecolaminas en una sola célula cromafín. Para ello, con una micropipeta de “patch clamp” Neher inyectó fura-2 (una sustancia que emite fluorescencia al combinarse con calcio) en una sola célula cromafín de la glándula suprarrenal.

Con la misma micropipeta pudo estimular la célula, que genera una corriente de calcio hacia el interior celular al abrirse los canales de calcio voltaje-dependientes.

El calcio que entra se combina con la fura-2, cuya señal fluorescente es captada por un equipo de microfluorimetría acoplado a un microscopio invertido y al sistema de “patch clamp”; finalmente,la misma micropipeta puede medir la capacidad eléctrica de la membrana celular,que es proporcional a la superficie celular.

Al fusionarse con el plasmalema las vesículas que almacenan catecolaminas su membrana se incorpora transitoriamente a la membrana plasmática, incrementando la superficie de la celular así como su capacidad eléctrica: esta capacidad es directamente proporcional a la intensidad del fenómeno secretor.

El registro simultáneo de estos tres parámetros ha permitido a Neher y colaboradores el esclarecimiento de cómo los niveles de calcio citosólico regulan la liberación de neurotransmisores y hormonas en varios tipos de células secretoras.

La persona

En julio pasado, la tarde caía lentamente en la Sajonia Alemana. ElWin y yo contemplábamos desde su coche los bellos valles de los alrededores de Gotinga, Los colores de los campos de cereales verdiamarillentos contrastaban con los verdes de las grandes arboledas que los circundaban. No se parecían a los amarillos sin fin de las llanuras manchegas, donde sólo algún pino ocasional los rompe.

Llegamos a un pueblecito de la antigua Alemania del Oeste, Duderstadt,con una iglesia de torre afilada y casas centenarias con fachadas plagadas de flores. Seguramente, desde la Universidad de Gotinga, alguno de los hermanos Grimm se deslizaba hacia aquel “pueblecito de juguete” para obtener una dosis de inspiración para algunos de sus cuentos de hadas, brujas, magos, príncipes, princesas y dragones.

Luego, ElWin me llevó a otro pueblecito cercano, Heilligenstadt (Ciudad de los Santos), ya en la antigua Alemania del Este. Era un lugar solitario: casas a medio construir, otra en reparación y escaparates de tiendas semivacíos, en proceso de transformación.

ElWin me contaba los pormenores de la reunificación alemana, pero yo inquería por los pormenores del descubrimiento de las técnicas de “patch clamp”. Saqué la impresión de que no le daba mayor importancia, y que atribuía al azar. y la suerte muchos de los hallazgos que condujeron a tan notorio descubrimiento.

A través de un programa de intercambio y colaboración mutua, he tenido la oportunidad y la suerte de compartir con el profesor Neher, en mi laboratorio y en el suyo, experiencias científicas y humanas. En junio pasado, un científico de la Clínica Mayo, de EE.UU. impartía un Seminario de Investigación en mi Departamento.

ElWin estaba entre el público. Al finalizar el Seminario se lo presenté y exclamó, sorprendido de encontrarle en aquella audiencia: “Oh, you are Neher, the man of the patch clamp!!!”. Esta anécdota refleja un impacto que sus descubrimientos han tenido en la comunidad científica internacional. Aunque quizás lo refleje mejor el hecho de haber sido elegido como uno de los pocos miembros extranjeros de la Academia Nacional de Ciencias de EE.UU. Entre otras cosas.