Glicoproteinas Salivales

GLICOPROTEINAS SALIVARES: VARIACIONES INTERPERSONALES DETECTADAS POR LECTINAS*

Doctor: CRISTOBAL CORREDOR R.**

SUMMARY

Unstimulated human saliva from Joung healthy latinamericans from about 6 a.m. and 11 a.m. showed interpersonal variability for bouth protein and glycoproteins. Con A, Ph, vulgaris and Ph. lunatus lectins precipiteled saliva glycoproteins, showing indivldual variability.

Similarly Con A, Eritrina rubrinervia lectins precipitated human serum glycoproteins in a direct linear fashion but PHA from Ph. lunatus and Ph vulgaris did precipitate serum glycoproteins but at lower levels.

A set internal (PI, PIR) and external (P.E., PER) stadars is proposed using both protein and glycoproteins from saliva and serum respectively.

Finally a home-made dispenser (dropper) is presented for the routine chemical analysis of glycoproteins precipitated by lectins.

RESUMEN

Saliva total humana sin estimular (población americolatina) tomada al despertar (-6 AM) y las 10-11AM., presenta una variabilidad interpersonal en cuanto a sus contenidos de proteína total, (a 280 nm). Dicha variabilidad se manifiesta también al tomar alguno de estos individuos y analizarles el contenido de glicoproteínas con lectinas tanto del suero como en saliva

Las lectinas Con A y Phaseolus Lunatus detectaron mejor las glicoproteínas salivales que la lectina Phaseolus vulgaris.

En suero la Con A y Eritrina rubrinervia reaccionaron mejor que Ph lunatusy Ph vulgaris. Se propone tomar patrones internos, (PI, PIR) y patrones externos (PE, PER) para proteínas y glicoproteínas tanto para suero como para saliva, dada las diferencias raciales entre subpoblaclones. finalmente se presenta una técnlca analítica (microanálisis) para estudiar glicoproteínas por lectinas, rápida y económica.

_______________________________________________________________________
* Programa de Biología Oral, Departamento de Morfología Facultad
de Medicina en colaboración con la Facultad de Odontología. U. N. Bogotá, Colombia.
** Profesor Asociado Facultad de Odontología Universidad Nacional de Colombia.

INTRODUCCIÓN

Las glicoproteínas son fenotipos bioquímicos que presentan un polimorfismo genético, (20-22-23),.fácil de estudiar Con técnicas de alta resolución como los electroforesis de afinidad (11-15, 24, 25, 26) o más directamente con técnicas de CDNA con precisión molecular (2, 20).

Recientemente se ha podido localizar el sitio dentro de un cromosoma en donde mora la secuencia de nucleotidos o el gen, que codifica una proteína en panicular, (2), como lo ha demostrado Mamule y Col., (18), al localizar el complejo proteínico salival humano en la región del brazo cono del cromosoma 12 como 12 p. 13.2, (30).

También se han estudiado en otros sistemas proteínicos, las variantes moleculares (mutaciones) de un gen o familia de genes, cortando el DNA con enzimas de restricción (Restriction fragment length polymorphisns) y estudiando su homología por técnicas electroforéticas en geles de agarosa, (30).

Dado que las glicoproteínas resultan de procesos complicados postranscripcionales que les dan una mi croheterogeneidad biológica en su parte glicosídica, el uso de leoninas (biomacromoléculas que “reconocen” azúcares) es la metodología para estudiar la variabilidad de las glicoproteínas en Biología Oral, tanto en solución (Secreción salival) como “in situ” (13, 14).

En los distintos análisis cuantitativos de componentes salivales (proteínas, cationes, aniones, hormonas, etc.) se establece que la variabilidad biológica es un componente predominante (9. 15, 23, 27). Reiff 1983, estudiando las glicoproteínas Ig G e Ig A humanas concluyó que la saliva era mejor indicador local de la respuesta inmunológica que el suero. En el presente trabajo usando las lectinas provenientes de leguminosas (Con A, Ph. lunatus, Ph. vulgaris) como agentes coprecipitantes de las glicoproteínas, presentes en la saliva de los jóvenes de raza Americolatina; se comprobó la variabilidad biológica interpersonal. Se propone una estandarización tanto con proteínas totales salivales y séricas con sus respectivas glicoproteínas. Finalmente se describe una técnica (micrométodo) para adelantar estos estudios, interdisciplinarios en la biología oral con fines prácticos ya que la saliva es un elemento de diagnóstico (1, 3, 7, 9, 10, 21, 24, 25, 27) o pronóstico no invasivo, practicable ambulatoriamente, (21). Para todo esto se requiere conocer epidemiológicamente los rangos de variabilidad existente en nuestras subpoblaciones Americolatinas.

METODOLOGÍA

Toma de Muestras

Tanto las glicoproteínas séricas como las de la saliva se obtuvieron de donantes jóvenes (20-27 años) todos de raza americolatina, clínicamente sanos (anamnesis) y hábitos socioculturales similares. El suero se obtuvo de sangre periférica entre las 10-11 a.m., (10 ml por persona). Clarificado por centrifugación se diluyó al 20% con solución salina (1% NaCl 0.02% NaN3) y se almacenó a 4°C hasta el momento de usarlo. El número de donantes se especifica en los resultados.

La saliva se tomó utilizando un tubo colector trampa, Fig.1, previo cepillado bucal meticuloso y enjuague de la cavidad oral con abundante agua destilada (20:C). Se procuró tomar muestras al despertar ( 6 a.m.) y a las 10-11 a-m.

Fig.1 Tubo colector trampa para la recolección de saliva de la cavidad oral. El conjunto es esterizable en autoclave. La muestra es admitida dentro del tubo, accionando lentamente el embudo de la jeringa.

Cada donante mantuvo el extremo de la manguera colectora debajo de la lengua con los labios cerrados. A la primera sensación de tener abundante saliva en la boca se succionaba suavemente con la jeringa (10 ml) hasta colectar un volumen de saliva de 8-10 ml.

La muestra fue clarificada por centrifugación (3.600 rpmx 30 mint). Luego el sobrenadante se esterilizó por filtración y se almacenó a 10°C hasta el momento de usarla. Muestras con altos contenidos de sustancias mucilaginosas o con precipitados o coloraciones leves se descartaron en el estudio.

Alternativamente para estudios comparativos que requieran almacenamientos prolongados o bajas temperaturas se añadió a cada saliva cristales de ácido sódico (NaN3) hasta hacerla 0.02%. Se repartió en recipientes de plástico en alicuatos de 2 ml y se almacenó a 4°C. Tanto para saliva como para suero se prepararon muestras “Patrón” de los individuos de población, en estudio.

Para esto se tomó para cada persona 1 ml. de cada una de las muestras individuales tomadas periódicamente, por tiempo lo a 35 días de cada individuo. Con estas preparaciones se caracterizaron cada una de las preparaciones de lectinas.

EXTRACCIÓN DE LECTINAS

Se seleccionaron granos secos de leguminosas previamente seleccionadas por tener buen índice de lectinas Ph. v. se extrajo del cultivar Sangretoro Phaseolus vulgaris; Ph.l del cultivo de fríjol Todo el año Phaseoulus lanatus; Con A se extrajo de la Canavalia ensiformis; y la E.r. de Eritrina rubrinervia, siguiendo la técnica de Liener 1976, (17). Cada extracto se almacenó a 4°C en 0.86% NaCl 0.02% NaN3; 0.001 M-Ca-Mg, permaneciendo activo por varios meses. La presencia de leves precipitados se eliminaban por centrifugación.

Estandarización de la Coprecipitación de Glicoproteínas por Lectinas

Para una concentración dada de una afinitina (lectina parificada o no), en relación con la concentración de sus receptores es de una importancia experimental y biológica.

Las curvas a, b, c y a’, b’, c’ son desviaciones de la ideal en las que las zonas a. a’ v b. b’ poseen distintas pendientes.

La concentración relativa de cada lectina se comprobó utilizando las mezclas patrón individual, tanto de la saliva como del suero. Se ajustó la concentración adecuada de cada lectina con el método de ensayo y error o sea diluyendo con solución salina, o concentrando la muestra de lectina (colocándola en una bolsa de diálisis en la nevera a 4°C durante vados días) según el caso.

Manteniendo uno de los sistemas interactuantes (en este caso la saliva o el suero diluido = K, = 0,1 ml), le agregamos volúmenes crecientes (25 a 300 ul) de lectinas. Después de homogenizar adecuadamente se dejó reaccionar por 10 horas aproximadamente. El cálculo de la proteína total (por colorimetría-espectrofotometría) en el coprecipitado aislado por centrifugación debe darnos una curva caracterizada por tres zonas A, B y C, tal como se esquematiza en la Figura 2.

Fig. 2 Curva ideal (A, B, C) de coprecipitación de glicoproteínas (séricas-salivales) por lectinas. A: zona de respuesta proporcional directa. B: zona de meseta. C: zona de respuesta proporcional inversa.

Coprecipitación de Glicoproteínas

Una vez patronado el “título” de cada lectina se procedió a analizar en igualdad de condiciones tanto la saliva como el suero de cada donante.

Para la coprecipitación se utilizaron microplacas de plástico con capacidad para 96 muestras, en las que en cada pozo se colocaba: 0,1 ml, de las soluciones de glicoproteínas (suero diluido o saliva) ya sea utilizando una pipeta de repetición o el dosificador de goteo (Figura 3), aplicando 7 gotas con aguja No, 18. Luego se aplicó 1, 2, 3 y 4 gotas de 25 ul cada) de lectinas para lo cual se utilizaba agujas No. 27. La velocidad de caída de cada gota se regulaba ajustando la presión hidrostático del sistema (Figura 2, h1), así como la posición de la llave excéntrica (Figura 2, S). Se dejó reaccionar con leve agitación sobre un disco inclinado giratorio, (33 rpm) durante 30 minutos. Luego se dejó en reposo a temperatura ambiente 1.5°C durante la noche.

Fig. 3 Dispensador de pequeños volúmenes (ul) por goteo. La velocidad de goteo se controla por la llave de paso
regulable G. así como también por la diferencia entre h1 y h2. Intercambiando el diámetro de la agua se puede tener gotas pequeñas (20 ul) o gotas grandes (30 ul).

El precipitado así formado separó por centrifugación (2.000 rpm; 470-490 g x 20 minutos) desechado el sobrenadante. Esto se obtuvo, invirtiendo la placa hacia abajo y con leve movimiento centrifugo del brazo se dejó escapar todos los sobrenadantes simultáneamente en una pileta. Seguidamente cada microplaca se dejó flotando en agua durante cinco minutos. Se mantuvo siempre la placa boca abajo para evitar que los líquidos remanentes se entremezclen de un pozo a otro alternando las mediciones. Se evitó además al máximo cualquier choque brusco ya que se podría desprender del fondo del pozo del coprecipitado. Una vez lavada la palma de la placa, manteniéndola boca abajo, se colocó así sobre papel absorbente, eliminando todo exceso de líquido de cada pozo. Un leve golpeteo asegura que gotas de liquido remanente bajen al papel absorbente.

Una vez secada la placa se volteó, boca arriba y se procedió a resolver el precipitado. Se añadió a cada pozo 0.1 ml. de KOH al 5% y se dejó que desapareciera el aspecto lechoso. Para medir la concentración de proteína en cada muestra, se transvasó la muestra meticulosamente a un tubo de ensayo (5 ml) y se añadió 1.5 ml. De KOH con la pipeta de repetición. Se registró la absorbancia utilizando un expectrofotómetro con luz ultravioleta (280 nm). Paralelamente se halló por igual método el contenido de proteína de 0.1 ml. del suero y de saliva de cada individuo tomando esto como su patrón interno (P.I.) individual relativo, el cual constituyó el 100% para normalizar estadísticamente cada individuo a su propia proteína respectivamente.

A cada una de las tres mediciones de cada tratamiento se calculó el coeficiente de variación descartándose aquellas lecturas cuyos valores sobrepasan del 20%. Se tomó albúmina bovina sérica (0.01%) para comprobar la linearidad de respuesta del equipo.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Glicoproteínas Detectadas por Lectinas:
Estandarización

Las lectinas químicamente caracterizadas como proteínas o glicoproteínas, son afinitinas, capaces de unirse no covaliente a los carbohidratos sin modificarlos químicamente. Esta unión obviamente posee cierto grado de afinidad, según la naturaleza de la lectina y la constitución química del receptor carbohidrato. Existen en la actualidad decenas de lectinas estudiadas, que al mezclarse con glicoproteínas en solución forman un complejo insoluble, fenómeno conocido como coprecipitación.

Esta asociación conglomerular desaparece al desnaturalizar los componentes con pH extremos, o por competencia con azúcares solubles.

Las razones por las cuales se debe hacer tipificación de cada lectina frente a un sistema biológico glicoproteínico, (fluidos como suero, saliva, orina, lágrimas, etc.) es para conocer el tipo de interacción entre la afinitina y sus receptores. (Fig. 2 zonas A, B y C) ya que: a) se desconoce la densidad y accequibilidad de los receptores (carbohidratos) de cada especie glicoprotéica reaccionante con la lectina en estudio. Cada fenotipo glicoproteínico reaccionante, se considera como polivalente (varios sitios de reconocimiento en cada cadena polipeptidica) frente a la lectina. b) usualmente las lectinas se consideran bi o tetravalente según la especie de lectina y las condiciones fisioquímicas durante la coprecipitación. Esto hace posible la existencia de cierta escala de “afinidades” dentro de los distintos fenotipos presentes en los fluidos biológicos. c) la presencia de receptores monovalentes en bajas concentraciones (glicolípidos-oligoglicopéctidos, carbohidratos, etc.) que por competencia con los polivalentes impiden la formación de macroagregados estables de fácil sedimentación por centrifugación, (26). D) también se desconoce la naturaleza química de cada cadena polipeptídica. Cadenas polipeptídicas ricas en aminoácidos hidrofóbicos (20) pueden inducir coprecipitaciones inespecíficas especialmente si la unión lectina-carbohidrato induce cambios conformacionales moleculares en ambos o en uno de los elementos del sistema coprecipitante.

Glicoproteínas Séricas

De los ocho individuos aquí analizados todos presentaron glicoproteínas séricas reaccionantes con las lectinas Con A y E.r., en la zona de respuesta proporcional (Fig. 2 zona A) y en forma análoga, (Fig. 4A y B). Es de anotar que con E.r. cuya especificidad es para carbohidratos tipo galactosa y galactosamina los tres jóvenes ( ♂ ) presentaron una coprecipitación escasa con las dosis de 25 y 50 ul de lectina comparada con el coprecipitado de las cinco mujeres ( ♀ ). Obsérvese que con estas dos lectinas existen disparidad de los datos lo que nos indica una variación interpersonal a nivel de glicoproteínas séricas.

Fig. 4 Glicoproteínas séricas reaccionantes con lectinas, en 9 jóvenes (♂.♀) americolatinas. Cada punto es promedio de 3 repeticiones. 9*. Individuo recuperado de hepatitis viral per “clínicamente” sano.

Respecto a las fitohemoaglutininas (Ph. v y Ph. l (Fig. 4C y D) los ocho individuos reaccionaron en forma similar estadísticamente pero el precipitado es mucho menor. Aquí la zona de respuesta proporcional y meseta (Fig. 2 zonas A y B) están poco definidas lo cual hace pensar que pudiesen existir fenómenos de coprecipitación inespecíficos tales como el efecto hidrofóbico, (19).

Estudios anteriores de Spengler y Wener 1980, así como de Glad y Borrebeck 1984, (11, 25), han demostrado que la lectina de Ph. vulgaris o PHA pueden coprecitar específicamente varias glicoproteínas séricas tales como la Ig A, Ig G, Ig M, β – lipoproteína, a2-microglobulina, a antitripsina, orosomucoide y a – lipoproteína humanas. Es importante resaltar aquí que las glicoproteínas séricas Ig A y Ig M monamérica, no son separables por coprecipitación, (25, 26).

Estudios comparativos que se adelantaron con sueros de especies herbívoras (bovinos y equinos) estos si presentan algos contenidos de fenotipos glicoprotémicos reaccionantes con Ph. v y Ph. 1.

Al normalizar los datos tomando en cada individuo su concentración de proteína sérica total como el 100% (Tabla 1B) se observó una distribución de datos similares, (Figura 5 I y II). Esto permitirá comparar en estudios posteriores varios individuos tomando como referencia su patrón interno lo cual hace menos sugestiva la agrupación de las variaciones interpersonales.

Tabla 1
Tabla 1 Promedios generales de glicoproteínas séricas humanas coprecipitadas por lectinas. A: = promedio general en unidades de absorbancia. CV, Gn = coeficiente de variación del promedio general (%) y su desviación estandar en cada tratamiento. B: porcentaje de glicoproteínas coprecipitadas, con relación al patrón interno PI sérico, (100%) de cada individuo. ♀= 5; ♂= 3.

Fig. 5 Coprecipitación de glicoproteínas séricas humanas por dosis crecientes (25, 50, 75 y 100 ul) de lectinas. Zonas de respuesta proporcional directa. I: valores de absorbancia. Cada punto es el promedio general de 8 individuos cada uno con 3 repeticiones para cada tratamiento. II: los mismos valores previa normalización con el patrón interno (proteína total sérica = P.I. = 100%).

La ventaja de esta normalización estadística obedece al criterio biológico de que se tiene en cuenta su estatus individual, genético, epigénetico. Por ejemplo, el caso 9 de la Figura 4, pertenecía a un individuo que se había recuperado satisfactoriamente desde el punto de vista clínico de hepatitis viral, pero aún presentaba niveles bajos de proteínas totales séricas. Este individuo presentó niveles de coprecipitación con Ph. v. más altos comparados con la población en estudio, lo cual indica que aún subsista alguna alteración en los fenómenos de glicosidación de este grupo de glicoproteinas séricas.

Un inconveniente de la normalización al 100% es el de que al hacerles el análisis estadístico los datos presentan mayor dispersión respecto a la media, con un incremento en los valores del coeficiente de variación, eliminando en algunos casos diferencias estadísticas. Además como la mayoría de estos fenómenos biológicos (coprecipitación por afinitinas) no siempre sigue una distribución simétrica o de Poison, en poblaciones no homogéneas, los casos extremos (con altos o bajos contenidos de glicoproteínas reaccionantes) se verán afectados estadísticamente. Pese a estos inconvenientes el autor sugiere que para adelantar estudios comparativos entre subpoblaciones se incluyan patrones tanto internos PI como externos PE, (como se especifica más adelante, Figura 7).

Dado el adelanto tecnológico existente para el análisis hematológico-sérico, el incluir las proteínas séricas como PI o PE para suero y saliva respectivamente también están justificadas dada la interdependencia anatomo-fisiológica existente, (5) entre ellos.

a. Proteína Total

En una población de 19 jóvenes americolatinos se realizó un muestreo durante un periodo aproximado de 35 días ( ♀ = 14 con 69 muestras y ♂= 5 con 28 muestras).

Dada la no regularidad de muestreo en algunos de los participantes, sólo nos referimos al hecho epidemiológico del contenido de proteína total agrupando los datos según muestreo por la mañana al tiempo de despertar (6 a.m.) y a las 10 a.m.

En la Tabla 2, se presentan los valores promedios. Se destaca aquí que el C.V. en cada determinación con tres repeticiones fue de 10.8% ± 9%, lo cual nos indica la confiabilidad del método de trabajo. Al comparar los datos obtenidos para cada dosis de lectina (ul) utilizados, nos da un rango de variación del C.V. entre el 20% y 38% lo cual nos indica la variabilidad interpersonal existente en cuanto a sus niveles de proteínas totales.

Tabla 2
M= Número de análisis; X unidades de absorbancia x 103 y CV sus coeficientes de variación %
Tabla 2 Valores de proteína total en saliva tomada periódicamente (lapso 35 días), tanto al despertar (6 a.m.) como a las 10-11 a.m. Población americolatinas jóvenes; =14, = individuos.

Las causas mayores pudiesen ser: a) Bioritmos hormonales, astrales, temporales; (4, 12); b) hábitos socioculturales, (3, 24) ; c) hábitos nutricionales (cantidad, calidad y frecuencia) (1, 9); d) ambientes ecológicos (epidemias virales, etc., humedad, temperatura, vientos locales, etc. ); e) patologías psicosomáticas y psicosociales y finalmente, o genéticas (2-15-22).

Tomando separadamente todas las muestras de las primeras horas al despertar ( 6 a.m.) y todas las muestras colectadas entre las 10 y 11 se ve una dispersión estadística difícil de interpretar. No obstante esto, al tomar rangos de valores de clase (unidades de absorbancia 0.020) y normalizar cada uno de los muestreos (M = 52 = 100% para el primer muestreo y M =45 = 100% para el segundo muestreo) se vé gráficamente que la población en estudio presenta una distribución asimétrica (curtosis), en ambas horas de muestreo, Figura 6. La población presenta al despertar un valor modal ligeramente superior al valor modal observado en salivas tomadas a las 10-11 a.m.

Este predominio podría obedecer al hecho de que durante el sueño o descanso nocturno la actividad de la flora microbiana es más activa (anaerobiosis); el aporte citoplásmico de las células de recambio (normal y bacterial) es máximo; el recambio de saliva es mínimo y obviamente hay ausencia de estímulos extrínsecos. Podemos entonces dividir la población según sus niveles de proteínas salivales (Figura 6) así: A = individuos con valores típicos (15% en la mañana y 24% en las horas de 19,11 a.m.); B = individuos con valores ligeramente elevados y C = individuos con valores altos. La variación interpersonal de los datos individuales nos impidió correlacionar si un mismo individuo en ambos muestreos pertenecía al mismo rango en ambos muestreos.

Fig.6 Distribución de frecuencia en % del contenido de proteínas en saliva tomada al despertar (6 a.m.) y hacia el medio día (11:00 a.m.) de individuos jóvenes americolatinos (unidades de absorbancia); 14; =15.

Es de observarse también que el grupo C sólo están formados por muestreos al despertar cuyas causas posibles ya se ha mencionado. Estos hallazgos concuerdan con los encontrados por Bhoola, Matthews and Roberts 1977, (4), quienes al estudiar 220 jóvenes, (♀), encontraron que el contenido de proteína también presentaba una dispersión de datos. Además ellos también anotaron que la saliva de las 10-11 hr, presentaba valores proteínicos más disparejos que los de la tarde, 14-16 hr., siendo la concentración de Kalekreina superior en la mañana que en la tarde. Así mismo reportaron que el aumento de Kalekreina también estaba asociado a cambios esteroides propios del ciclo menstrual, (12). Sería de gran valor epidemiológico poder establecer la procedencia cualitativa de estos componentes y correlacionarlos con sus posibles causas de su aparición o inducción.

b. Glicoproteínas Salivales

Al analizar las glicoproteínas salivales precipitables por lectinas en 8 individuos de la población en estudio se pudo encontrar nuevamente la variabilidad interpersonal (Figura 7). Aquí se pudo observar que a pesar de haber “patronadó” cada lectina previamente con suero humano, no todos los individuos presentaron una coprecipitación personal a la cantidad de lectina aplicada, lo cual es una prueba mayor de la variabilidad interpersonal. Obsérvese además que la saliva total posee más glicoproteínas solubles reacciorantes con Ph. 1 que en el mismo suero humano. Es oportuno recalcar aquí que una calibración con mezclas de salivas de varios individuos no es aconsejable ya que basta que un solo individuo aporte una especie o fenotipo altamente polivalente y de una calidad de carbohidratos (receptores) óptimamente accequibles y altamente afines para viciar la calibración. Esto es razonable discutirlo ya que justamente los componentes protéicos salivales pueden tener un alto grado de complejidad glicocídica, (16-23-28).

Fig. 7 Variación interpersonal promedio en el contenido de glicoproteínas salivales en 7 jóvenes americolatinos,
Hora de muestra 6-8 a.m. sin estimulación. 1 = 10 muestras; 2 = 15 muestras; 3 = 12 muestras, 4 = 9 muestras; 5 = 8 muestras, 6 = 10 muestras y 7 = 9 muestras.g

Aquellas especies altamente reactivas con lectinas favorecerían entonces la formación de conglomerados moleculares grandes junto con glicoproteínas de pocos receptores y de baja afinidad estabilizando el coprecipitado.

Es pertinente anotar que dado el alto grado de glicosidación de alguna de las glicoproteínas salivales (16), los métodos calorimétricos no son estrictamente confiables como lo demostró Wu y colaboradores (28), utilizando una glicoproteína de la saliva del armadillo.

Esta calibración o patronaje sobre estimaría las preparaciones de lectinas que al usarlas con muestras de saliva individuales no medirían fielmente los niveles de receptores glicoproteínicos dando valores contradictorios o érráticos difíciles de interpretar. Esto invalidará todo intento de comparación entre individuos o en un mismo individuo en diferentes circunstancias fisiológicas normales o en enfermedad) como se ha demostrado en otros estudios al usar otra afinitina (anticuerpos) para evaluar niveles de antígenos en humanos, (31).

Pero reducir estos errores experimentales se propone pues que todo estudio de la determinación de niveles glicoproteínicos por lectinas debe contar con dos patrones al interno (P.l. = proteína total salival) y el patrón externo, (P.E. = proteína total sérica), tal como se esquematiza en la Figura 8 vías 1,2). Alternativamente para glicoproteínas séricas podría ser: patrón interno (P.I. = proteínas totales séricas) y patrón externo (P.E. = proteínas totales salivares), Figura 8 vías 3 y 4. Un patrón más estricto podría ser el tomar como referencia glicoproteínas totales solubles precipitadas por una lectina de “especificidad” conocida o de referencia (PIR o PER), Figura 8 vías 5 y 6 respectivamente para saliva. Este último caso se justifica cuando las glicoproteínas están correlacionadas fisiológicamente entre sí (positiva o negativamente en mecanismos homeostáticos ó de auto-regulación). Obviamente los cálculos estadísticos para comparar su correlación se deben hacer una vez conocido el comportamiento idealizado en la Figura 2 al comienzo de la zona en meseta B.

Fig. 8 Patrones internos, Pi, y externos, PE, biológicos individuales, utilizados en el estudio sistemático de glicoproteínas salivales por coproprecipitación con lectinas.

Finalmente al usar el término “saliva no estimulada” es una expresión poco exacta ya que de acuerdo a la metodología para tomar la saliva aquí expuesta se induce (positiva o negativamente) un factor que podría aumentar la variabilidad interpersonal difícil de evaluar como se observó en algunos de los donantes.

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