Terapia Génica en Enfermedades Autoinmunes

Dra. GLORIA MARÍA VÁSQUEZ D
Internista _Reumatóloga
Candidata a PhD en Inmunología

Resumen

En la actualidad la terapia génica para las enfermedades inflamatorias y autoinmunes constituye un amplio tema de estudio. Al comienzo de la utilización de la terapia génica como herramienta terapéutica los investigadores pensaban que ésta era sólo útil en enfermedades monogénicas. Hoy el conocimiento más profundo de las enfermedades autoinmunes ha hecho de ella una posible herramienta terapéutica con promisorios resultados.

La AR dentro de este grupo de entidades es la más frecuentemente evaluada. Los sinoviocitos y fibroblastos constituyen las células más utilizadas y los genes de citoquinas o de sus bloqueadores los de más utilización.

Dentro de este grupo de moléculas cabe destacar el IL-1Ra. Es uno de los genes más utilizados en los protocolos actuales y es el primero utilizado en un protocolo clínico en humanos.

Otras moléculas de activación celular o de muerte (apoptosis) también han sido de interés.

La terapia génica es aún un “futuro” terapéutico pero ella constituye en la actualidad una herramienta muy valiosa para el entendimiento de la fisiopatología de estas entidades.

Summary

Current knowledge suggests that gene therapy can be also effective in the treatment of the polygenic diseases, such as inflammatory and autoimmune diseases.

In this type of diseases, RA is the most widely used model. The cytokine genes or cytokine inhibitors are the proteins used for synovial cells o fibroblasts transformation.

Human clinical trials with the IL1-Ra gene have been performed with promising results.

Other genes coding for cell death inductors or several cytokines have been used, too.

Even thought more trials are needed to evaluate gene therapy as an adequate treatment in inflammatory and autoimmune diseases, invaluable information regarding the pathophysiology of these diseases is being obtained with this approach.

La transferencia de genes en humanos es una estrategia por medio de la cual el repertorio genético de las células somáticas es modificado con propósitos terapéuticos o de ayuda en el entendimiento de los fenómenos biológicos1-2.

En el año de 1963 Joshua Lerderberg escribió “Nosotros podemos predecir que se utilizarán los cultivos “in vitro” de células germinales y la manipulación de ellas por el intercambio de cromosomas o genes”3.

En el año de 1966 Edward Tatum en una conferencia denominada :

“Reflexiones sobre la investigación y el futuro de la medicina” decía “El triunfo de la ingeniería genética puede obtenerse cuando las propias células del paciente. Por ejemplo, las células hepáticas, crecidas en cultivo sean transformadas con un nuevo gen originado por mutación directa de células normales, genes de un donador insertados por transducción o por transferencia directa de DNA”3.

Después de años de múltiples estudios e investigaciones, la terapia génica en humanos ha progresado desde la especulación a la realidad en corto tiempo. El primer estudio clínico (aun solo utilizando un gen marcador) se realizó en 1989 y el primer protocolo clínico aprobado por la FDA para el manejo de la inmunodeficiencia por defecto en la producción de ADA (adenosin desaminasa) comenzó en septiembre de 1990. Para el año de 1992 ya existían 11 protocolos clínicos activos en los tres continentes para hoy existen más de 532 protocolos clínicos en ejecución3.

Los primeros investigadores sugerían que esta terapia era solo útil en enfermedades monogenéticas hereditarias, en la actualidad representa una forma de “tratamiento” de otras entidades en forma local o sistémica1-3.

Sus aplicaciones se extienden desde enfermedades genéticas hasta el cáncer, infecciones adquiridas, enfermedades neuro-degenerativas, enfermedades autoinmunes y otras.

Esencialmente la transferencia de genes incluye:

La forma de transporte o vectorización del gen
La célula blanco
El gen elegido
Control de la expresión del gen.

Este procedimiento puede ser llevado a cabo “ex vivo”, procedimiento en el cual “el material genético elegido”. Es introducido a las células en el laboratorio y las células modificadas son posteriormente reinfundidas al receptor.

Alternativamente la transferencia de genes puede hacerse “in vivo” en un procedimiento en el cual el “material genético elegido es introducido directamente a las células del individuo. A su vez éste puede ser de dos clases “in situ” o “en forma sistémica o parenteral”.

En ambas estrategias el proceso de transferencia es usualmente realizado por un vector que ayuda a dispensar el material genético dentro del sistema celular donde este puede funcionar apropiadamente1,4.

Forma de transporte o inserción del gen

Varios métodos han sido desarrollados para liberar y expresar genes exógenos estos incluyen2 los sigientes sistemas:

Químicos: precipitación con fosfato de calcio, DEAE- dextran, polybreno, liposomas neutros, aniónicos, catiónicos, y conjugados e polilisina.

Físicos: microinyección, electroporación, biobalistica.

Biológicos: Retrovirus, virus derivados del Herpes (HSV), los adenovirus y los virus asociados a los adenovirus.

En la actualidad para protocolos clínicos los vectores más utilizados son los retrovirus, los adenovirus y los liposomas.

Los retrovirus fueron aislados inicialmente por su capacidad oncogénica en aves y ratones. Estos virus son muy similares en su genoma y son capaces de causar enfermedad neoplásica en sus respectivos huéspedes naturales.

Los retrovirus poseen dos cadenas idénticas de RNA simple que se encuentran al igual que sus enzimas de replicación. Contenidas dentro de una cubierta proteica viral, esta estructura está rodeada por la envoltura viral, cuya función es mediar la infección de la célula huésped.

La infección se inicia cuando el virion penetra a la célula blanco a través de interacciones específicas entre las glicoproteínas de la envoltura del virion y los receptores expresados en la superficie externa de la célula. La fusión entre la membrana celular y la envoltura viral, permite la internalización del virion ya sea por fusión directa entre estas membranas o endocitosis.

Posteriormente en el citoplasma de la célula se produce la liberación de la cubierta viral, quedando libre el RNA viral, el cual es transcrito por la transcriptasa reversa a una doble cadena de DNA que posteriormente se transporta al núcleo de la célula. En el núcleo, el DNA viral es integrado establemente en el genoma de la célula blanco.

Este DNA integrado se denomina provirus:

El cual se replicara durante el ciclo celular junto con el material genético de la célula. El DNA proviral es transcrito a RNA y transportado al citoplasma de la célula donde las proteínas y las enzimas de replicación son transcritas y ensambladas junto con el RNA viral, formando una nueva particular viral con el potencial de infectar a otras células.

Todos los retrovirus poseen tres genes estructurales (gag, pol y env). gag codifica para las proteínas que forman la capside, pol codifica para las enzimas de replicación como la transcriptasa reversa y la integrasa y env codifica para las glicoproteínas de la envoltura. Estos genes estructurales están localizados entre dos secuencias idénticas denominadas LTR (Long, Terminal, Repeat) colocadas a cada extremo del genoma viral.

Debido a que los retrovirus pueden integrarse en el genoma de la célula infectada y expresar posteriormente los genes virales en todas las células que infectan y en su progenie, los retrovirus han sido utilizados para introducir genes de interés en las células somáticas.

Para ello, son manipulados y convertidos en virus defectivos para la replicación, capaces de infectar e integrarse en la célula blanco, en un ciclo de infección abortivo. Los vectores retrovirales se obtienen entonces a partir de retrovirus naturales, a los cuales se les reemplaza parte de sus genes estructurales (gag, pol, env), por uno o varios genes, bien sea un gen reportero o bien, el gen terapéutico deseado. La expresión de ambos tipos de genes puede ser dirigida por el mismo promotor retroviral (LTR) o por promotores exógenos introducidos en el vector.

Después de suprimir los genes que codifican las estructuras proteicas virales y las proteínas que median la replicación viral:

Estos vectores retrovirales pueden ser producidos únicamente en unas líneas celulares de empaquetamiento, que son capaces de aportar por transcomplementación las proteínas retrovirales estructurales. La línea de empaquetamiento es construida por transfección estable de los genes estructurales gag, pol y env eliminados del vector retroviral. De tal manera que estas proteínas son producidas y ensambladas en las células de empaquetamiento.

Estas células son transfectadas con el vector retroviral que posee el gen de interés y por transcomplementación se generan partículas virales recombinantes defectuosas con altos títulos de infección y libres de virus competentes para la replicación.

Estos vectores retrovirales, tienen la capacidad de integrarse en el cromosoma de la célula infectada y de transmitir información genética de generación en generación, permitiendo la expresión de un gen o genes insertados por un período más largo, evitando la necesidad de infecciones repetidas. El tamaño del gen insertado puede ser de hasta 8 Kb.

Una vez integrado en el genoma de la célula blanco este es estable. Lo cual reduce la posibilidad de rearreglos genéticos que puedan potencialmente dar origen a mutaciones o reestructuraciones cromosómicas que afecten la expresión de otros genes, son poco inmunogénicos, son ideales para aplicaciones “ex vivo” y además poseen un amplio espectro de hospederos e infectan sólo células que estén activas mitoticamente. Su biología ha sido bien comprendida y por esto su utilización en protocolos experimentales y terapéuticos se incrementa día a día7-11.

Los adenovirus que ha perdido los genes que le dan capacidad de replicación:

Son buenos vehículos para dispensar genes “in vivo” ellos son capaces de infectar células quiescentes y persisten como DNAs no integrados. Por su baja eficiencia es necesario utilizar virus a títulos muy altos que podrían desencadenar respuesta inflamatoria inespecífica1-3. Estos virus tienen la capacidad de acomodar material genético de hasta 20Kb. Pero la expresión de la proteína es limitada a solo semanas o meses por la falta de integración del DNA,. Por esto se requiere readministración que puede desencadenar respuesta inmune y limitar su eficiencia.

Estos vectores entran a la célula por medio de dos receptores: el receptor de la fibra del adenovirus y el avb3/avb5 esto dos últimos receptores. Tienen la capacidad de disparar señales a través de las MAPKinasas que pueden resultar en activación de la cox-2 y por ende del foco inflamatorio observado cuando se usan estos vectores adenovirales5.

Otros sistemas vectoriales menos bien desarrollados que pueden tener aplicación en la terapia génica han sido derivados de virus adenoasociados (AAV), Herpes virus, vaccinia virus y varios virus RNA.

Los AAV son virus relativamente pequeños, estables y pueden infectar células humanas. Su integración dentro del genoma receptor u hospedador es menos precisa ya que las repeticiones en tandem (que facilitan la integración viral) sufren deleciones o rearreglos que dificultan está inserción1-2 sólo en el caso de los virus vectores. Ya que los salvajes se conocen tienen integración específica en el cromosoma 19. Se ha atribuido a estos virus la capacidad de insertarse en células quiescentes, pero son pocas las evidencias de esta característica2.

El herpes virus puede ser una herramienta muy valiosa en células del sistema nervioso central. Pero aún queda en duda la existencia de un Herpes virus no replicativo o sin capacidad de producir derivados tóxicos, lo que pone en duda la seguridad de su utilización.

Otros métodos vectoriales son los químicos entre ellos los liposomas los cuales tienen varias composiciones entre ellas por ejemplo: cadenas de lípidos cationinos sintéticos.

El liposoma positivamente cargado se une al plasmido conteniendo el gen de interés, el cual está negativamente cargado. El complejo entra a la célula blanco por fusión con la membrana plasmática1-3.

Este sistema vectorial no tiene ningún componente estructural que conlleve un transporte específico al núcleo como consecuencia de esto la mayoría de los nuevos genes introducidos se pierden. Dentro de las organelas citoplasmáticas y los que alcanzan el núcleo en terapias realizadas “in vivo”, funcionan como material epicromosomal.

En teoría los complejos plasmido-liposoma tienen algunas ventajas como vectores de transferencia de genes ya que ellos pueden usarse con material genético de tamaño ilimitado. No se replican o recombinan como los vectores virales y generan poca respuesta inflamatoria e inmune por no poseer componente proteico. La desventaja es su ineficiencia requiriéndose concentraciones muy altas de plasmidos para lograr una transferencia eficiente2-3.