Amplificación al Azar del Polimorfismo del ADN (RAPD) de Cepas de E.Coli 0157:H7

Aisladas de Pacientes Pediátricos

BQ. Raúl Poutou, MSc;Profesor Asistente. Jefe del Laboratorio de
Biotecnología Aplicada. Departamento de Microbiología, Facultad
de Ciencias. Pontificia Universidad Javeriana. Bogotá D.C.
Dr. Salim Máttar Ph.D. Profesor Asociado. Universidad de Córdoba.
Instituto de Investigaciones Biomédicas del Trópico, Facultad de
Medicina Veterinaria, Montería, Colombia

Resumen

Objetivo. Determinar la diversidad genética entre cepas de E.coli O157:H7 aisladas en diferentes hospitales de Bogotá, a través de la amplificación al azar del polimorfismo del ADN (RAPD).

Materiales y métodos. En el estudio se incluyeron 14 cepas procedentes de casos esporádicos de diarrea de pacientes pediátricos en Bogotá, aisladas entre marzo de 1996 y marzo de 1997. Para seleccionar el cebador (“primers”) más apropiado se probaron 17 cebadores de la serie OPA (Operon Technologies inc. Alameda, California, USA). El PCR fue realizado en un volumen final de 25 l, conteniendo tampón de PCR 1X, 1,5mM de MgCL2, 0.2mM de cada dNTP, 40pmol del iniciador y 1U de la ADN polimerasa Taq, más 25mg de ADN. Para establecer la distancia genética según el RAPD entre las 14 cepas de ECEH O157:H7 se construyó un dendograma utilizando una matriz de 0 (ausencia de bandas) y 1 (presencia de bandas) que fue procesada con el programa de computación “Systat 5.0” de SPSS, Chicago, Illinois. U.S.A. 1995).

Resultados. Los mejores resultados fueron obtenidos con el cebador OPA-07, el cual fue empleado en la caracterización molecular de las 14 cepas seleccionadas; generando entre 1 y 15 bandas polimórficas de ADN con tallas moleculares entre 1,018 y 5,090 bp. La utilización del iniciador OPA-07, permitió agrupar las cepas en 11 RAPD tipos diferentes. La distancia genética entre los RAPD tipos reportó distancias genéticas entre 0.04 y 0.79.

Conclusiones. El análisis de RAPD permitió concluir que al menos dos líneas clonales altamente relacionadas de E.coli O157:H7 estuvieron circulando por Bogotá en un período de un año que demoró el estudio.

Palabras claves: E.coli O157:H7, RAPD, distancia clonal, diversidad genética.

Introducción

Escherichia coli enterohemorrágica O157:H7, es una bacteria productora de verotoxinas, cuya potente actividad causa depleciones de la mucina, infiltración de polimorfonucleares en la mucosa e incremento de la actividad mitótica en las criptas del colon, generando fuertes dolores abdominales, diarrea acuosa que progresivamente se convierte en colitis hemorrágica. Estudios de 1997 y 1998 reportan que en Colombia la incidencia de O157:H7 está emergiendo como agente causal de gastroenteritis aguda (GEA) y síndrome urémico hemolítico (SUH)1-4. La técnica de RAPD se basa en la amplificación al azar del ADN genómico empleando cebadores (primers) simples. Estos cebadores detectan el polimorfismo del ADN en caso de no contar con la información de una secuencia específica de ADN, estos cebadores amplifican varios loci indeterminados, generando una serie de fragmentos que permiten diferenciar entre cepas del mismo serotipo. Este método es mucho más sensible que la ribotipificación y que la electroforesis enzimática de los multilocus, sin embargo, el RAPD es tan sensible como el PFGE Con relación a esta técnica son pocos los trabajos de epidemiología que se hayan publicado en relación a O157:H7, a diferencia de lo que ocurre con los serotipos O27:H7, O29:H21, O153:H45, O6:H6 y O128ac:H12 de Escherichia coli enterotoxigénica (ECET)5-8. El objetivo de este estudio fue el de determinar la diversidad genética entre cepas de E.coli O157:H7 aisladas en diferentes hospitales de Bogotá, a través de la amplificación al azar del polimorfismo del ADN (RAPD).

Materiales y Métodos

Se llevó a cabo un estudio observacional descriptivo que fue realizado en la Unidad de Microbiología Especial, Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias, Pontificia Universidad Javeriana.

Se analizaron 14 cepas de E.coli enterohemo-rrágica (ECEH) provenientes de casos aislados de diarrea de pacientes pediátricos de Bogotá. Los aislamientos provenientes de una colección bacteriana confeccionada entre marzo de 1996 y marzo de 1997 fueron previamente caracterizadas como O157:H7 por la Unidad de Microbiología Especial1.

Extracción del ADN Cromosomal

Las bacterias se cultivaron durante 12 horas a 37oC y 250 r.p.m. en caldo LB. Un mililitro del cultivo fue centrifugado durante 10 minutos y las células obtenidas fueron lavadas con tampón TE 1X (10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8:0). Para la lisis celular el “pellet” resultante fue resuspendido en 200 ml de tampón TE1X más 2mg/ml de lisozima durante 30 minutos a 37oC. Seguidamente para lograr la degradación de las proteínas se añadieron 300 ml de tampón TE 1X más 1% v/v de SDS y proteinasa K a concentración final de 100mg/ml; la mezcla fue incubada a 65oC durante una hora. Para eliminar los péptidos y lípidos residuales se añadieron 84ml de una solución 5M de NaCL más 60ml de CTAB (10% p/v CTAB disuelto en 0.7M de NaCL). La suspensión resultante fue tratada con una mezcla 24:1 de fenol y cloroformo. Una vez separadas las fases por centrifugación, la fase acuosa fue tratada con 2-propanol para lograr la precipitación del ADN. El ADN precipitado fue lavado con etanol al 70% v/v, secado a 37oC y resuspendido en agua destilada.

Cuantificación de ADN

La pureza y la concentración del ADN fue determinada según la relación entre la absorbancia a 260, 280 y 320 nm de longitud de onda según lo reportado por Sambrook 19899.

Electroforesis de ADN

Los ADN fueron separados electroforéticamente en un gel de agarosa al 1% p/v preparado en tampón TAE 1X (40mM Tris-acetato, 1mM EDTA pH 8:0). Los geles fueron teñidos en una solución con 5mg/ml de bromuro de etidio y fotografiados bajo luz ultravioleta9.

Marcador de Talla Molecular

Como marcador de talla molecular se empleó el marcador “1Kb ladder” (Gibco BRL, USA).

Reacciones de RAPD

La técnica de PCR fue realizada en un volumen final de 25ml, conteniendo tampón de PCR 1X, 1,5mM de MgCL2, 0.2mM de cada dNTP, 40pmol del iniciador y 1U de la ADN polimerasa Taq, más 25 ng de ADN. La temperatura fue controlada de la siguiente manera: 5 minutos a 94oC, seguido de 30 ciclos compuestos por 30 segundos a 94oC, 30 segundos a 36oC, 30 segundos a 72oC y un proceso de extensión final de 4 minutos a 72oC.

Iniciadores (“Primers”)

Las reacciones de RAPD fueron realizadas empleando 17 de los iniciadores de la serie OPA (Operon Technologies inc. Alameda, California), los que fueron seleccionados de acuerdo a la composición de G (guanina) y C (citocina) (tabla No 1).

Tabla No 1. Secuencias de los iniciadores OPA,
empleados en las reacciones de RAPD.

Análisis de los Patrones de RAPD

Los patrones fueron considerados diferentes, cuando al menos se detectó una banda polimórfica de ADN. La relación entre las muestras de ADN fue estimada utilizando el coeficiente definido por Jaccard, P.8: S = a/(a+b+c), donde a es el número de bandas de ADN compartidas entre las cepas 1 y 2, b es el número de bandas de ADN presentes en 1 pero no en 2 y c es el número de bandas de ADN presentes en 2 pero no en 1. En este análisis resultados superiores a 1 significa la presencia de patrones de RAPD diferentes. Para establecer la distancia genética según el RAPD entre las 16 cepas de ECEH O157:H7 estudiadas por esta técnica, se construyó un dendograma utilizando una matriz de 0 (ausencia de bandas) y 1 (presencia de bandas) que fue procesada con el programa de computación “Systat 5.0” de SPSS, Chicago, Illinois. U.S.A. 1995).