Malformaciones Craneofaciales Inducidas por Acido Retinoico en Ratas

Craniofacial malformations induced by the retinoic acid in rats

Teresa González Otero, MD*; Luis Lassaletta Atienza, MD**; Leopoldo Martínez Martínez, MD***, Juan Antonio Tovar Larrucea, MD****; Vicente Martorell Martínez, MD*****

* Médico adjunto. Servicio de Cirugía Maxilofacial.
** Médico adjunto. Servicio de O.R.L.
*** Médico adjunto. Departamento de Cirugía Pediátrica.
**** Jefe de Departamento. Departamento de Cirugía Pediátrica.
***** Jefe de Servicio. Servicio de Cirugía Maxilofacial,
Hospital Universitario “La Paz”. Madrid. España.

Correspondencia:
Teresa González Otero – Servicio de Cirugía Maxilofacial
Hospital Universitario La Paz – Paseo de la Castellana, 261
28046 Madrid
Tfno: 91 727 7336 – Fax: 91 637 60 96
e-mail: gusarapillo2003@yahoo.es

Resumen

Objetivo: La vitamina A y sus derivados son teratógenos bien conocidos. Este trabajo estudia el efecto de la exposición temprana de embriones de rata al ácido retinoico sobre las estructuras craneofaciales.

Diseño: Cuarenta y cinco ratas Sprague-Dawley gestantes fueron expuestas a 125 mg/kg de ácido all-trans-retinoico el día 10 de gestación. Las ratas controles fueron tratadas con aceite de oliva. Los fetos de ambos grupos se extrajeron el día previo a llegar a término mediante cesárea y fueron sometidos a un estudio morfológico, analizando las malformaciones craneofaciales.

Resultados: Ninguno de los fetos controles presentó malformaciones, mientras que el 100% de los embriones tratados con retinoico tuvieron defectos craneofaciales. Las malformaciones incluyeron fisuras faciales, exoftalmos, malformaciones del pabellón auricular incluyendo desde pabellones dismórficos hasta anotia, inserción baja de los pabellones auriculares, apéndices faciales y anomalías nasales como aumento de la giba nasal y puente deprimido.

Conclusiones: Nuestros datos confirman la hipótesis según la cual el ácido retinoico altera el desarrollo craneofacial. Una alteración en la migración de las células de la cresta neural sería la razón que explicaría estas anomalías.

Palabras clave:  Ácido retinoico, ratas Sprague-Dawley, embriopatía, cresta neural, malformaciones craneofaciales.

Abstract

Objective: Vitamin A and its derivatives are well-known teratogens. The present study examines the effects of early exposure of rat embryos to retinoic acid on craniofacial structures.

Design: Forty-five pregnant Sprague-Dawley rats were exposed on gestational day 10 to 125mg./Kg all-trans-retinoic acid. Controls were treated only with oil. The fetuses were recovered next term and a morphologic investigation of the craniofacial malformations was performed.

Results: None of the control fetuses had malformations whereas craniofacial defects were observed in 100% of the retinoic embryos. Malformations included facial clefts, proptosis, abnormalities of the pinnae ranging from dysmorphia to anotia, inferior placement of the pinnae, skin tags, and nasal anomalies including pronounced hump and depressed nasal bridge..

Conclusions: Our data confirms the hypothesis that retinoic acid disturbs normal craniofacial development. Hindrance of migration of the cranial neural crest cells may be a main reason to explain these events.

Key words: retinoic acid, Sprague-Dawley rats, embriopathy, neural crest, craniofacial malformations

Introducción

Los niños que acuden al especialista con malformaciones craneofaciales suponen un reto importante para éste. Si bien estas malformaciones la mayor parte de las vecesno suponen un riesgo vital, marcan al niño y a su familia de por vida. Muchos de ellos necesitarán múltiples y complejas intervenciones quirúrgicas para intentar que su apariencia facial llegue a ser lo más normal posible.

Entre las malformaciones craneofaciales, destacan por su frecuencia en la práctica clínica los síndromes de fisuras orofaciales (labio y paladar hendido) y los síndromes de primer y segundo arcos branquiales como los síndromes de Franceschetti-Zwahlen-Klein, Treacher-Collins y la microsomía hemifacial.

Aunque muchas malformaciones congénitas son de causa genética, un grupo considerable tienen una etiología multifactorial. Se considera que alrededor del 8-10% de las malformaciones congénitas son consecuencia de agentes teratógenos. Entre estas sustancias destacan la vitamina A y sus derivados. El ácido 13 cis-retinoico (Accutane®) es un retinoide sintético que comenzó a utilizarse en Estados Unidos en 1982 para el tratamiento del acné quístico severo.

Gracias a sus efectos en la diferenciación epitelial celular y su relativa baja toxicidad, los resultados fueron buenos desde el punto de vista clínico. Sus efectos secundarios en adultos son mínimos, pero no puede ser consumido durante el embarazo. En 1986 Webster y cols. (1) documentaron defectos congénitos en 24 niños nacidos de 200 mujeres expuestas al retinoide durante las primeras semanas del embarazo. Cuando la exposición se produjo durante el primer mes de gestación, tres días y medio eran suficientes para ocasionar malformaciones.

Los principales defectos fueron anomalías craneofaciales y cardiovasculares, tales como fisura palatina, depresión del tercio medio facial, anomalías en los procesos maxilares y el pabellón auricular, arcos aórticos hipoplásicos y defectos de septación en aurículas y ventrículos. El éster etretinato (Tigason®) es un derivado sintético de la vitamina A que empezó a utilizarse en diciembre de 1986 para el tratamiento de la psoriasis. A diferencia del Accutane®, que tiene una vida media de 16-24 horas y se metaboliza rápidamente, el etretinato se almacena en los tejidos, y sus metabolitos se han llegado a encontrar incluso hasta tres años después de la ingesta inicial.

Debido a su prolongada vida media y la persistencia de su potencial para producir defectos congénitos, se recomienda embarazadasrse a las mujeres que han estado en tratamiento con etretinato durante al menos los dos años siguientes a su empleo (2).

Para profundizar en la patogenia y en las bases moleculares de estas malformaciones y contar con herramientas que nos permitan combatirlas, son muy útiles los modelos animales, en los que podemos reproducir las alteraciones. Existen pocos estudios de este tipo, ya que es muy difícil encontrar un modelo de experimentación en el que los resultados puedan ser considerados válidos.

Hay muchos teratógenos que teóricamente pueden inducir malformaciones craneofaciales en distintas especies. Sinembargo, al producir tasas de mortalidad elevadas y/o escasas malformaciones no son útiles para estudios experimentales. El agente teratógeno ideal será aquel capaz de producir una elevada frecuencia de malformaciones concretas con una baja tasa de mortalidad fetal. En nuestro estudio empleamos el ácido all-trans-retinoico diluido en aceite de oliva que cumple ambas condiciones.

El objetivo de este trabajo es demostrar que la exposición de ratas gestantes al ácido retinoico induce malformaciones craneofaciales a sus embriones, y realizar un estudio descriptivo de dichas malformaciones.

Material y  Método

Se emplearon ratas Sprague-Dawley hembras vírgenes de 220-250 gramos de peso y machos de fertilidad probada. Los animales fueron alojados en las instalaciones del laboratorio experimental del hospital La Paz de Madrid y fueron alimentados con el granulado especial para rata, y agua de bebida “ad libitum”. Su manejo se ajustó a las exigencias de la Unión Europea vigentes (E.C. 86/L609) y a las recogidas en el R.D. 223/1988.

En el grupo del ácido retinoico las hembras recibieron una sola dosis de 125mg./Kg. de ácido all-trans-retinoico diluido en aceite de oliva a una dilución de 40 mg./ml. administrado mediante una sonda nasogástrica el día 10 de gestación. Los animales del grupo control recibieron una dosis de 125 mg./Kg. de aceite de oliva por sonda nasogástrica en el día 9.5 de gestación.

El día cero de la gestación fue contado a partir del momento en que se demostró la presencia de espermatozoides en el frotis vaginal. La cesárea se practicó el día 21 bajo anestesia general (el embrión es a término con 22 días). Para la selección de los animales del grupo control se eligieron aleatoriamente 4 animales por camada, mientras que para la selección de los animales del grupo retinoico se eligieron aleatoriamente 5 animales por camada. Los animales seleccionados de los dos grupos fueron fijados en formol al 10% durante 48-72 horas. A continuación se realizó el estudio macroscópico de las estructuras craneofaciales.

Las variables analizadas fueron las siguientes: Existencia y tipo de fisuras faciales (maxilar, mandibular o ambas), presencia de exoftalmos en cada lado, ausencia de bigotes en cada lado, implantación normal o baja de ambos pabellones auriculares, malformaciones de pabellón auricular (anotia, microtia o pabellón dismórfico), presencia y localización de apéndices faciales y deformidades nasales (puente nasal deprimido, giba aumentada o narinas antevertidas).

Resultados

Ninguno de los fetos controles presentó alteraciones de las variables estudiadas. La figura 1 resume la incidencia de malformaciones craneofaciales en los fetos tratados con ácido retinoico. El 57,8% (26/45) de los fetos tratados con retinoico presentaron fisuras faciales, de los cuales 13 fueron maxilares, nueve mandibulares y cuatro tanto maxilares como mandibulares.

Figura 1. Gráfico que muestra la incidencia de malformaciones craneofaciales en los fetos tratados con ácido retinoico.

El 78% (35/45) de los fetos tratados con retinoico tuvieron exoftalmos en el lado derecho, mientras que el mismo porcentaje tuvieron exoftalmos en el lado izquierdo (Figura 2).

Figura 2. Feto tratado con ácido retinoico que presenta una combinación de fisuras maxilar (3) y mandibular (4) , se observan también apéndices faciales (2) y exoftalmos (1).

Al 20% de los fetos tratados con ácido retinoico les faltaban los bigotes en el lado derecho de la cara y al 13 % en el lado izquierdo. El 90% de los fetos tratados con ácido retinoico tuvieron pabellones auriculares de implantación baja en el lado derecho y el 86% en el izquierdo.

De los fetos expuestos al ácido retinoico, el 64.4% presentaban malformaciones del pabellón auricular derecho ( 22.2% dismorfia, 31.1% microtia y 11.1% anotia) y el 64% presentaban malformaciones del pabellón izquierdo (11.1% dismorfia, 31.1% microtia y 22.2% anotia). El 60 % (27/45) de los fetos tratados con ácido retinoico tuvieron apéndices faciales en el lado derecho. Sus localizaciones fueron: doce preauriculares, tres con tercer mamelón aislado de His, once de comisura oral y uno con presencia de mamelón de His más otro apéndice en comisura (Figura 3).

Figura 3. Feto tratado con ácido retinoico que presenta microtia (1) con implantación baja y tercer mamelón de his (2), narinas antevertidas (3) y exoftalmos.

El 64,4 % (29/45) de los fetos tratados con ácido retinoico tuvieron apéndices faciales en el lado izquierdo. Sus localizaciones fueron: catorce preauriculares, tres con tercer mamelón aislado de His, nueve de comisura y tres preauriculares más comisura. El 55% de los fetos tratados con retinoico presentaron algún tipo de deformidad nasal: 4% narinas antevertidas, 11% aumento de la giba nasal, 2% puente deprimido y 38% distintas combinaciones de las anteriores.

Discusión

El efecto teratogénico de los retinoides en humanos es bien conocido (3). Los modelos animales de malformaciones humanas permiten estudiar los mecanismos y secuencias del desarrollo de dichas malformaciones. En nuestro estudio encontramos una implantación baja del pabellón auricular en el 86% y el 90% de los fetos tratados con retinoico, en el lado derecho e izquierdo respectivamente. En el estudio de Ganström y cols. (4) en los fetos tratados con retinoico los pabellones también eran más inferiores, pero a diferencia de nuestro estudio, más posteriores. Igualmente encontramos que más de la mitad de los fetos tratados con retinoico presentaban fisuras faciales.

Estas se producen como consecuencia de un defecto de fusión entre los procesos faciales durante las fases precoces de la organogénesis, que dan lugar a fisuras faciales o fístulas entre los procesos mandibulares, maxilares, y entre los procesos nasales medial y lateral. Varios autores han descrito la existencia de fisuras faciales sin especificar localización ni incidencia (1, 5).

En nuestro estudio se documentó la ausencia de bigotes en fetos tratados con retinoico en el 20% de los casos en el lado derecho y en el 13% de los casos en el lado izquierdo. Al igual que todas las estructuras anteriormente mencionadas, el desarrollo normal de los precursores de las vibrisas que darán lugar a los bigotes depende también de la migración correcta de las células de la cresta neural al proceso maxilar del que derivan. Granström y Kullaa-Mikkonen (6) describieron la presencia de vasos aberrantes y observaron que la ausencia de bigotes era más frecuente en el lado de los vasos aberrantes.

Las malformaciones de los pabellones auriculares son las más frecuentes en la mayor parte de los estudios, sólo superadas por la presencia de apéndices cutáneos (tags). En nuestro estudio aparecen todo tipo de malformaciones, desde microtia a anotia pasando por diferentes grados de dismorfia del pabellón auricular.

De hecho, solamente el 36,6 % de los pabellones de los fetos tratados con ácido retinoico fueron normales, tanto en el lado derecho como en el izquierdo. Jacobsson y Granström (7) encontraron un 67,3 % de malformaciones auriculares en fetos tratados con etretinato. Sin embargo, estos autores no especifican el tipo de malformación. Sí lo hicieron, en cambio, Jarvis y cols., (7) quienes relacionaron el tipo y la incidencia de malformaciones de pabellón auricular con el momento de administración del ácido retinoico.

Los fetos tratados con retinoico presentaron apéndices faciales en el lado derecho en el 60% de los casos, y en el lado izquierdo en el 64,4%. Este resultado es similar al encontrado por Jacobsson y Granström (6) que describieron un 68% de apéndices faciales en el total de embriones, sin diferenciar entre ambos lados. En la mayoría de los fetos tratados con retinoico aparecen apéndices faciales localizados mayoritariamente entre la comisura de la boca y el pabellón auricular.

Estos apéndices cutáneos faciales, especialmente los preauriculares y el tercer mamelón de His aislado, se asocian a un defecto en la formación del pabellón auricular y son un dato evidente de una morfogénesis alterada. En nuestro estudio, tanto la afectación del pabellón auricular como la presencia de apéndices faciales es bastante simétrica en ambos lados; no ocurre lo mismo en otros trabajos, como el de Jarvis y cols. (7) en el que el lado derecho estaba más frecuente y más severamente afectado que el izquierdo.

En nuestro estudio más de la mitad de los fetos tratados con retinoico presentaban malformaciones nasales de algún tipo como narinas antevertidas, giba aumentada y puente deprimido, o diferentes combinaciones de las mismas,. Todo ello se puede atribuir a un defecto en el desarrollo del proceso frontonasal como consecuencia de un defecto en la migración células de la cresta neural craneal que han de invadirlo para que se desarrolle adecuadamente. Granström y Kullaa-Mikkonen (6), en un estudio sobre malformaciones nasales en fetos tratados con retinoico describieron distintas mal formaciones nasales entre las que incluyeron una descripción de las alteraciones de los cartílagos nasales: cartílago parietotecal ensanchado y deforme, cartílago septal reducido, cartílago paranasal ausente, y cartílago paraseptal distanciado del proceso palatino.

El día del desarrollo embriológico en el que se administra el teratógeno es muy importante, puesto que éste es un proceso dinámico y los órganos se desarrollan de manera secuencial en diferentes días (5). Nosotros administramos el teratógeno las primeras horas del día 10 de gestación y las malformaciones que encontramos son todas ellas en tejidos derivados de los arcos branquiales y del proceso frontonasal, por tanto tejidos en cuyo desarrollo juegan un papel crucial las células de la cresta neural craneal.

En la mayoría de los estudios mencionados hasta el momento el periodo de máximo riesgo para el desarrollo de este tipo de malformaciones es entre el día 9 y 9.5, lo cual podría explicar algunas diferencias entre nuestro estudio experimental con ácido retinoico y los de otros autores.

En función de los resultados obtenidos en nuestro trabajo, compartimos la idea de que el origen de las malformaciones craneofaciales está en la alteración de las células de la cresta neural craneal. Esta teoría fue inicialmente propuesta por Mc Credie (9,10) en la embriopatía por talidomida y más tarde ampliamente defendida por Jhonston (11,12) en la teratogénesis de la hipervitaminosis A. Se considera que existe un déficit en el mesénquima de los arcos branquiales y del proceso frontonasal como resultado de un fallo en el proceso de migración de las células de la cresta neural craneal y de su contribución a los primordios faciales.

Esta matriz deficiente altera las interacciones morfogenéticas normales que ocurren en esta área y causa las malformaciones. Los cambios más llamativos en los fetos de madres sometidas a la acción del ácido retinoico afectan a las células de la cresta neural craneal; también afecta a los derivados de la cresta neural troncal, aunque mucho menos. Estos cambios incluyen tanto disminución del numero de células como patrones anormales de migración.

Esto supone defectos de cierre en los procesos faciales y alteraciones y retrasos en la diferenciación de los derivados craneofaciales. Esta teoría es la más aceptada en el momento actual y existen múltiples estudios que la apoyan (6,13-15).

En conclusión, la exposición de ratas Sprague-Dawley al ácido retinoico en el día 10 de gestación induce importantes malformaciones craneofaciales en sus embriones, probablemente ocasionadas por una alteración en la migración de las células de la cresta neural craneal a los primordios faciales en desarrollo, es decir al proceso frontonasal y a los arcos branquiales.

Bibliografía

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