Análisis Bioquímico Tigénico y Alergénico de Extractos de Hemileia Vastatrix, Comparación entre grupos

Considerando los resultados obtenidos en la Prueba Cutánea (Prick Test) al utilizar el extracto de Hemileia vastatrix  Coca, hubo una diferencia significativa entre los grupos I y IV (p= 0,034) y entre los grupos II y IV (p= 0,040) (Prueba del Chi Cuadrado) (gráfico 1).

Considerando la Prueba Intradérmica realizada con extracto Hemileia vastatrix-Coca (p= 0,028) y entre los grupos I y IV (p= 0,017) (gráfico 2), diferencias significativas también fueron observadas entre los mismos grupos al analizar si los resultados obtenidos con pruebas realizadas con los extractos Hemileia vastatrix-Tris HCL (datos no presentados). Detección de las fracciones alergénicas de los extractos Hemileia vastatrix

Detectamos la presencia de IgE Específica contra 20 fracciones proteicas del extracto de Hemileia vastatrix en los sueros de los individuos que presentaban Pruebas Cutáneas positivas.

En contraste, los sueros de los individuos con Pruebas Cutáneas negativas no evidenciaron IgE Reactivas contra las proteínas del hongo (fig. 4).

Las fracciones antigénicas de 24 KD fueron reconocidas por un número mayor de sueros (4 y 3, respectivamente) (gráfico3).

Discusión

La existencia de grandes plantaciones de café en Brasil, y las condiciones favorables climáticas, posibilitó la diseminación del hongo Hemileia vastatrix en regiones caficultoras.

La elevada incidencia de sensibilización a la Roya del Café en el total de individuos investigados (alrededor de el 9%), indica que el Hemileia vastatrix puede ser un importante aeroalergeno en nuestro medio y no apenas en las regiones caficultoras.

Los extractos brutos que obtuvimos a partir de las esporas de la Hemileia vastatrix presentan bajas concentraciones proteicas, siendo inadecuados para uso diagnóstico. Para resolver ese problema, que parece ser común en la preparación de los extractos de basiodiomicetos, algunos autores recomiendan que la extracción sea realizada con sustancia bicarbonatada y que sean reconstituidos en la concentración de 5 y 10 mg de proteína por ml (9-11).

De hecho, el extracto obtenido con líquido de Coca, una sustancia bicarbonatada presentó mayor cantidad de proteínas.

Sin embargo, los perfiles electroforéticos de los 2 extractos obtenidos con líquido de Coca y Tris HCL, fueron semejantes; también observamos diferencias significantes al preparar los resultados de las pruebas realizadas con los 2 extractos.

En conclusión, podemos decir que, cuando se utilizan concentraciones proteicas adecuadas, no hay diferencia en cuanto a los 2 métodos de extracción.

Uno de los factores que dificulta el estudio de la alergia a los hongos, es la gran variabilidad antigénica que presentan, principalmente cuando son cultivados in vitro (1-2).

Debemos resaltar que los extractos de Hemileia vastatrix que preparamos, fueron obtenidos directamente de las esporas del hongo y que de esta forma no sufrieron interferencias en los medios de cultura.

Identificamos, en el suero de individuos que presentan Pruebas Cutáneas positivas, la presencia de IgE reactiva contra veinte fracciones proteicas de Hemileia vastatrix.

Padrón de reactividad

El padrón de reactividad fue heterogéneo, siendo imposible identificar una fracción alergénica principal primero por que el número de muestras fue pequeño y porque la existencia de reacciones cruzadas entre los Basidiomicetos dificulta muchas veces la identificación de los alergenos propios de una especie (8, 10, 26, 28). De Zubiria et al. (29).

Sugieren inclusive que antígenos comunes podrían ser utilizados como indicadores de sensibilización a algunas especies de Basidiomicetos relacionadas entre sí.

En los extractos de Hemileia vastatrix encontramos elevado tenor de carbohidratos. Estudios realizados por Moraes (30), demostraron que la mayor parte de los carbohidratos encontrados en las esporas de Hemileia vastatrix, serían lecitinas, necesarias para la adhesión específica entre las esporas y las hojas del cafeto.

Reacciones inespecíficas podrían ser observadas en las Pruebas Cutáneas debido a la presencia de lecitinas en los extractos.

Creemos poco probable que esto haya ocurrido pues, si así fuera, habríamos observado un número mayor de pruebas positivas y no serían observadas diferencias significativas entre atópicos y no atópicos.

Además de eso, demostramos in vitro la presencia de IgE Específica para Hemileia vastatrix.

Reforzando la hipótesis de mecanismo alérgico, de cualquier forma sería aconsejable obtener extractos de carbohidratos para realizar Pruebas Cutáneas.

Observamos que los grupos formados por individuos procedentes de las regiones caficultoras, muestran un porcentaje mayor de Pruebas Cutáneas positivas en relación con los individuos procedentes de otras regiones.

El análisis estadístico de esos resultados reveló diferencia significativa apenas en los grupos I y IV y entre los grupos II y IV, lo que evidencia una sensibilización significativamente mayor en atópicos residentes en regiones productoras de café comparados con individuos procedentes de otras regiones (atópicos o no atópicos).

Para explicar la elevada frecuencia de Pruebas Cutáneas positivas:

Inclusive en individuos residentes de las regiones que no producen café, debemos hacer algunas consideraciones, primero las esporas de Hemileia vastatrix pueden diseminarse por largas distancias y es probable que pueda sensibilizar personas, así residan lejos de las regiones productoras de café.

Podemos sospechar que la sensibilización de los individuos haya ocurrido en viajes por el interior del Brasil, en dirección a las regiones caficultoras.

En este caso, sería interesante estudiar la sensibilización del Basidiomiceto Hemileia vastatrix en individuos que residan en países no productores de café; por otro lado, el hecho de que existan reacciones cruzadas entre los Baidiomicetos, puede elevar el número de pruebas positivas (26-29).

Plantaciones como las de cacao y caña de azúcar, también pueden estar acometidas por hongos tipo Roya. No hay estudios sobre el potencial alergénico de esas especies de hongos.

Es probable que la población brasilera se encuentre sensibilizada a Basidio-micetos que afecten otros cultivos.

La incidencia de sensibilización en los trabajadores rurales no presentó diferencia significante en relación a los demás grupos.

Este grupo se comportó de forma semejante al grupo II (individuos no atópicos residentes en regiones caficultoras).

Riesgo de sensibilización en trabajadores rurales

Tal observación nos lleva a pensar que el riesgo de sensibilización en trabajadores rurales no es mayor que el de las personas que viven en ciudades próximas a las plantaciones de café.

Para una conclusión al respecto, sería recomendable estudiar mayor número de trabajadores, incluyendo un grupo de trabajadores atópicos y de sus familiares.

Finalmente, para confirmar la hipótesis de que la inhalación de las esporas de Hemileia vastatrix pueden desencadenar crisis de asma y rinitis en individuos sensibilizados, sería necesaria la realización de pruebas de provocación específica (nasal, conjuntival o bronquial) (31).

Dentro de esa línea de investigación, otras especies de Basidiomicetos podrán ser estudiadas con la finalidad de conocer mejor los aeroalergenos de cada región brasilera.

Agradecimientos

Al Sr. Isaac Castro, Biólogo del Departamento de Nefrología (LIM 12) de la Facultad de Medicina la Universidad de Sao Paulo, por el apoyo y colaboración en el análisis estadístico de este trabajo.

Summary

Basidiomycete fungi can be important allergens. The basidiomycete Hemileia Vastatrix. The causative agent of coffee rust, produce abundant anemophilus spores that may reach heights of more than 1000 meters and propagate over large disrtances.

To desmostrate the sensitization by this fungus, the precence of specific IgE, and its possible relationship with allergic respiratory diseases, skin test for immediate reading(prick Tests and Intradermal Tests)Were applied to 378 individuals divided into four groups, according to origin (coffee growing region or not) and occurrence of atopy plus a group of 50 rural workers.

Extracts were prepared from Hemileia Vastarix spores Using Coca Liquid and Tris-HCL as extracting solutions.

Extracts at conentartion of 2.0 mg protein /ml were used for the prick test and extract at concetration of 0,02 mg protein/ ml.were used for the intradermal Test.

Comparison of the results obtained showed that the number of atopic patients residing in coffee-growing regions (group IV) was significanthy higher than normal sujects (group I) (p¿0,034). No significant difference was observed between the test carried with difference extracts at equivatent protein concentrations.

The immunobltting technique detected specific IgE for 20 protein bands of Hemileia Vastatrix in the serum of 17 individuals who presented positive tests to the fungus.

We conclude that the basidiomycete Hemileia Vastatrix can sensitize human beings, inducing the synthesis of specific IgE and that the sensitization is Higher among atopic individuals residing in brasilian coffee-growing regions.

Bibliografía

• 1. Salvaggio J, Aukrust L. Mold-induced asthma.J Allergy Clin Immunol 1981; 68: 327-46.
• 2. Burge AH. Fungus Allergens. Clin Rev Allergy 1985; 2. 319-29.
• 3. Salvaggio JE, Klein R Neuw Orleans Asthma: characterization of individuals involved in epidemics J Allergy 1967; 39: 227-30.
• 4. Salvaggio JE, Seabury J, Schoenhardt EA. New Orleans Astma. Vrelatinship between Charity Hospital admissión rates, semiquantitative pollen an fungal spore, counts and total particulateaeromeritric sampling data. J Allergy Clin Immunol 1971; 48: 96-114.
• 5. Sprenger JD, Altman LC, O´neil CE, Ayars GH, Butcher BT, Lehrer SB. Prevalence ob Basidiospore allergy in the pacific Nortwest. L Allergy Clin Immunol 1988; 82: 1076-80.
• 6. Guannini EH, Northey WT, Leathers CR. The Allergenic signi-ficance of certain fungi rarely repoted as allergens. Ann Allergy 1975; 35: 372-6.
• 7. López M, Salvaggio JE, Butcher BT. Allergenicity and immunogenecity of Basidiomycetes. J Allergy Clin Immunol, 1976; 57: 480-7.
• 8. Hasnain SM, Wilson JD, Newhook FJ. Allergy to basidiospores: immunologic studies. NZ Med J 1985; 98: 342-6.
• 9. Lehrer SB, López M, Butcher BT, Olson J, Reed M, sanvaggio JE. Basidiomycete mycelia and spore-allergen extracts: skin test reactivity in adults andsymptoms
• 10. Honer WE, O¨neil CE, Lehrer SB. Basidiomycete allergens: comparisión of three Ganoderma species, Allergy 1993; 48: 116-9.
• 11. Lehrer SB, Hughes JM, Altman LC, et al. Prevalence of basi-diomycete allergy in the USA and Europe and its relationship to allergic respiratory symptoms. Allergy 1994; 49: 460-5.
• 12. Becker- Ratering S. El sistema Coffea spp y Hemileia Vastatrix. In: Becker – Ratering S, Moraes W, Quijano- Rico M, eds. La Roya del Cafeto – Conocimiebnto y control. Eschborn – Deutsche Gesellschaft fur Technische Zuammenarbeit (GTZ) 1991; 7 -28.

Referencias

• 13. Porto -Alegre P. Monografía do café – História, Cultura e reproduccao. Lisboa, Viuva Bertrand & C”. 1879.
  14. Vizioli J. Estudo preliminar na moleléstia das folhas do cafeeiro causada pela Hemileia Vastatrix. Sao Paulo, secretaria da Agriculltura, Comercio e Obras públicas do estado de Sao Paulo – servico de Publicacoes, 1992.
• 15. Martínez JA. Constatacao de esporos de Hemileia Vastarix no ar. In: Grupo Executivo de Racionalizacao da Cafeicultura, eds. Relatórios das pesquisas sobre Hemileia Vastatrix Berk et.Br. Primeira reuniao anual, 1971. Brasilia: Ministerio da Industria e Comercio. 1991; 1-4.
• 16. Saldiva PHN, Lichtenfels AJFC, Paiva PSO, Barone IA, Martins MA, Massad E, Pereira JCR, Xavier VP, Singer JM, Bohm GM. Association between air pollution and mortality due respiratory diseases in children in Sao Paulo, Brazil: A preliminary report, Environ Res 1994; 65: 218-25.
• 17. Gambale W, Pascuali JR, Croce J, Paula CR, correa B, Souza EM. Testes intradermicos con Hemileia Vastatrix en Asmáticos. Rev Microbilo 1989; 20 (suppl 1): 358.
• 18. Mendes E. Alergia no Brasil. Alérgenos regionais e inmunote-rapia. Sao Paulo, Manole 1989.
• 19. Scott TA, Melvin EH. Determination of Dextran with antione. Ann Chem 1953; 25: 1955-61.
• 20. Lowry OH, Rosembrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Protein measurement With The Folin-Phenol reagent. J Bilol Chem 1951; 193: 265-76.
• 21. Frings SW. Determination of Lipids. Clinical Chem 1972; 18: 763-9.
• 22. Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electroforetic transfer of proteins from polyacrilamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some aplications. Proc Natl Acad Sci USA 1979; 76: 4350-1.
• 24. Lombardero M, González R, Duffort O, Juan F, Ayuso JR, Ventas P, Cortés C, Carreira J. Evaluación de la actividad bioló-gica total y composición alergénica de extractos alergénicos. Allergol et Immunopathol 1986; 14: 189-98.

Fuentes

• 25. Turkeltaub PC, Rastogi SC, Baer H, Anderson MC, Norman PS. A standarized quantitative skin-test assay of allergen potency and stability: studies on the allergen dose – response curve abd effect of wheal, erytema and patients selection on assay results. J Allergy Clin Immunol 1982; 70: 343-54.
• 26. Santilli J Jr., Rockwell WJ, Collins RP. The significance of the spores of basidiomycetes (mushrooms and their allies) in bronchial astma and allergic rhinitis. Ann Allergy 1985; 55:469-71.
• 27. Mc. Cants ML, Lehrer SB, Bousquet J, Davies RJ0, Malling HJ, Sastre J, Schultze-Werninghaus G. Prevalence of basidiospore skin test reactivity in Europe. J Allergy Clin Immunol 1990; 85: 249-56.
• 28. Horner WE, O´neil CE, Lehrer SB. Basidiospore aeroallergens. Clin Rev Allergy 1992; 10: 191-211.
• 29. De Zubiría A, Horner WE, Lehrer SB, Evidence for crros-reactive allergens among basidyomicetes: Immunoprint-inhibition studies. J Allergy Clini Immunol 1990; 86: 26-33.
• 30. Moraes WBC. Bioquímica de la resistencia: Un control alternativo de la roya de Cafeto. In. Becker-Ratering S, Moraes W, Quijano – Rico M, eds. La Roya del cafeto – conocimiento y control. Eschborn: Deutsche Gesellschaft fur Technisque Zusammernar-beit (GTZ) 1991; 112-32.
• 31.López M, Voigtlander JR, Salvaggio JE, Lehrer SB. Broncho-provocation studies of Basidispore (BS) skin test and RAST po-sitive asthmatic. J Allergy Clin Immunol 1987; 79: 207-11.

“Cuanto más grande es el artista, mayores son sus dudas, la confianza absoluta se concede a los menos talentosos como premio de consolación”
Robert Hughes