Análisis Bioquímico, Antigénico y Alergénico de Extractos de Hemileia Vastatrix (Roya del café)
Miguel Croce*1, Eliúde Rosa da Costa Manso1, 2, Walderez Gambale3, Fabio F. Morato Castro1, Enio Pasquali4, José Enrique Pereira Pinto2, Claudia Eugenia de Oliveira Andrade5, Jorge Kleber Chavasco6, Lilian Takayama7, Eloisa Bonfá7, Julio Croce1, Santiago López Ortega8**.
Los hongos Basidiomicetos son aeroalergenos todavía poco estudiados. El bacidiomiceto Hemileia vastatrix es conocido por causar la roya en las plantaciones del café.
Este hongo produce abundantes esporas anemófilas que pueden alcanzar alturas superiores a mil metros sobre la tierra y propagarse por largas distancia en la atmósfera.
Un estudio preliminar en Brasil, demostró que la inhalación de esas esporas puede sensibilizar a individuos que residen en zonas caficultoras.
Pruebas cutáneas utilizando los extractos de Hemileia vastatrix
Con la finalidad de demostrar la presencia del IgE Específica a ese hongo y la posible relación con enfermedades respiratorias alérgicas, fueron realizadas pruebas cutáneas de lectura inmediata en 378 individuos, utilizando los extractos de Hemileia vastatrix.
Los extractos fueron preparados con las esporas del hongo. Utilizado líquido de Coca y tris HCL como solución extractora. Para las pruebas intradérmicas se utilizó extracto en concentración de 0,02 mg. de proteína por mL.
Los individuos fueron divididos en cuatro grupos de acuerdo con la procedencia (regiones caficultoras y no caficultoras) y la aparición de síntomas alérgicos, y un grupo de 50 trabajadores rurales de haciendas cafeteras.
Se observó que hubo un número significativamente mayor de pacientes sensibilizados en el grupo IV (atópicos de zona caficultoras).
Por la técnica de Western blotting, fue detectada IgE Específica en 20 bandas proteicas de Hemileia vastatrix en el suero de individuos que presentaban pruebas positivas para ese hongo.
Concluimos que ese basidiomiseto Hemileia vastatrix es capaz de sensibilizar al ser humano, induciendo síntesis de IgE Específica, y que hay mayor sensibilización en individuos atópicos residentes en regiones caficultoras.
Introducción
En alergología el conocimiento de los alérgenos ambientales es esencial para un diagnóstico etiológico. Dentro de los alergenos conocidos, los hongos son los que sufren mayor variabilidad de un ambiente para otro (1).
Hasta recientemente, la mayoría de las especies de hongos conocidas como alergénicas, eran casi exclusivamente pertenecientes a la subdivisión Deuteromycotina (2). Los Basidiomicetos despertaron la atención de los investigadores solamente en la década de los 70 (3-4).
A partir de esto, fue demostrada la existencia de alergia a varias especies de Basidiomicetos (5-11). Los Basidiomicetos comprenden, aproximadamente, 25.000 especies de hongos que incluyen los Hongos “orejas de Palo”, “Bolets” o “mush eooms”, “Blrackeet Fingi” y las Royas.
Su característica principal es poseer una estructura cónica llamada Basidio, donde son formados los basaidioporos. La mayo-ría de las especies libera esporas en la atmósfera en forma estacional.
Las Royas son parásitas vegetales exclusivamente, o sea, cada especie es exclusiva de una única especie vegetal. Sus esporas presentan formas morfológicas variadas, con un diámetro medio de 10 um.
El basidiomiceto Hemileia vastatrix
El basidiomiceto Hemileia vastatrix es el causante de la Roya del Café (12). Pertenece a la subdivisión Basidiomycotina, Familia Pucciniaceae, orden Uredinales (royas).
El Café (Coffea Arábica) es una planta originaria de la alta Etiopía (13). Los efectos estimulantes de la bebidas preparada con sus frutos fueron descubiertos por los Arabes.
A partir del siglo XVII, los europeos difundieron largamente su cultura en las colonias orientales y posteriormente en América (fig. 1).
El hongo Hemileia vastatrix también fue primeramente identificado en Etiopía, en el siglo XIX, y si-guió la misma ruta del Café. Atacando grandes plantaciones y causando grandes daños (14) (fig. 2).
En el Brasil, la Roya del Café fue detectada a partir de 1970.
El hongo parasita la hoja del café
El hongo parasita la hoja del café, produciendo manchas de color amarillo anaranjado en el envés de la misma.
Una de las características de la Hemileia vastatrix es la de esporular en ciertas épocas entre los meses de mayo y octubre, en esos meses son liberadas grandes cantidades de las esporas (12).
En las proximidades de las plantaciones de café afectadas por la Roya. Se observa una alta concentración de esporas en suspensión en el aire (15).
El aumento de incidencia de crisis de asma y rinitis en los meses de invierno no ocurre solamente en las ciudades industrializadas. Donde los niveles de polución y frío son algunos de los desencadenantes y agravantes de las crisis y del aumento de la mortalidad por enfermedades respiratorias (16).
Las regiones del interior del país también presentan mayor incidencia de crisis de asma en el invierno. Y probablemente hay otros factores ambientales que contribuyen para esos hechos.
El primer relato sugiriendo la capacidad alergénica del hongo Hemileia vastatrix fue hecho por Gambade et al. (17).
Testes cutáneos con extracto de Hemileia vastatrix
Los autores realizaron testes cutáneos con extracto de Hemileia vastatrix en 36 individuos asmáticos, procedentes de la ciudad Paulistana de Ribeirao Preto. Encontraron 3 individuos (8.3%) con reacción positiva.
Los datos preliminares, demostrando la existencia de individuos sensibilizados, llevaron a la sospecha de que la inhalación de las esporas del hongos Hemileia vastatrix pudiera estar relacionada con el desencadenamiento de las crisis de asma.
El hecho tendría importancia en las regiones productoras de café. Principalmente en los individuos que presentan crisis durante los meses de invierno.
El primer objetivo del trabajo fue estandarizar el extracto del hongo Hemileia vastatrix adecuado para ser utilizado en Pruebas Cutáneas.
Hongo desconocido en alergología
Como se trata de un Hongo todavía desconocido en alergología, fue necesario realizar análisis de la composición bioquímica y proteica de los extractos obtenidos.
El segundo objetivo fue determinar la incidencia de sensibilización al hongo Hemileia vastatrix en una pequeña muestra de la población brasilera.
Con tal finalidad fueron realizados Pruebas Cutáneas en grupos de individuos residentes en regiones productoras de Café y compararlos con individuos procedentes de otras regiones.
Finalmente, demos-trar in vitro la existencia de IgE Específica para Hemileia vastatrix. En el suero de individuos sensibilizados.
Casuística y métodos
Fueron estudiados uredosporas del hongo Hemileia vastatrix recolectados directamente de las hojas del cafeto (Coffea Arábica) contaminadas por el hongo.
Fue empleado el método de raspado directo de las lesiones micóticas de la hoja utilizando una lámina metálica.
La preparación de los extractos fue realizada en la propor-ción 10% (peso antígeno versus volumen del líquido extractor) de acuerdo con el método citado por Mendes (18), utilizándose como sustancias extractoras el líquido de Coca, sin fenol, y o Tris – HCL 0,05 M (pH 8,0).
Resumidamente, luego del lavado del material y secado en la estufa, la masa fúngica fue triturada, luego mezclada con el líquido extractor, permaneciendo en constante agitación durante siete días, a 4 grados centígrados luego centrifugación, y el sobrenadante sometido a diálisis contra agua destilada y carbonato de Amonio 0,1 M. Los extractos así obtenidos pasaron por pruebas bacteriológicas para asegurar su esterilidad.
Posteriormente, fueron analizados en cuanto su contenido de carbohidratos por los métodos de Scott & Melvin (19), de proteínas por el método de Lowry (20) y de lípidos por el método de Frings (21).
El fraccionamiento y caracterización de las proteínas de los extractos brutos fueron realizados por electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). Según el método descrito por Towbin (22). Utilizando padrones de bajo peso molecular (Calibration Kids, LMW 14.000 – 94.000, Pharmacia Laboratories, Usppsala, Sweden).
Casuística
Fueron realizados test cutáneos con extractos de Hemileia vastatrix en 378 individuos distribuidos en cinco grupos, de acuerdo con el padecimiento de atopia y la procedencia (regiones caficultoras y regiones no caficultoras). Los grupos fueron constituidos según tabla 1.
Grupo I. 51 individuos no atópicos residentes en la región urbana de la ciudad de Sao Paulo (Región no caficultora),
Grupo II. 118 individuos atópicos residentes en la región urbana de la ciudad de Sao Paulo (Región no caficultora);
Grupo III. 57 individuos no atópicos residentes en la región de Ribeirao Preto (SP) y del sur de Minas Geraris (ciudades de Alfenas, Varginha e Itajubá) (Regiones caficultora);
Grupo IV. 102 individuos atópicos procedentes de las misma regiones caficultoras, y
Grupo V. 50 trabajadores rurales de las plantaciones de Café (Hacienda Café de Minas. Alfenas – MG).
La investigación fue aprobada por el comité de Etica del Hospital das Clínicas de la Facultad de Medicina de la Universidad de Sao Paulo Brasil.
Y los participantes firmaron un consentimiento, después de ser informados de los objetivos de la investigación y de los riesgos posibles.
Como criterios de atopia fueron considerados la historia Clínica de Asma y/o Rinitis desencadenadas por alergenos y el tener una prueba cutánea (Prick Test) positivo a los alergenos del medio ambiente.
Pruebas cutáneas y estandarización de extractos
Los extractos de Hemileia vastratix, obtenidos con líquido de Coca y Tris – HCL, respectivamente, fueron liofilizados y posteriormente reconstituidos en agua deionizada en las siguientes concentraciones proteicas:
- Para pruebas de Puntura (Prick Test): concentración de 2 mg/ml;
- Para pruebas intradérmicas. Concentraciones de 0,02 mg/ml.
- Como control negativo líquido de Coca y Tris-HCL, respectivamente.
Para determinar la sensibilidad a los aeroalergenos comunes, fueron utilizadas Pruebas Cutáneas (Prick Test) con extractos de Dermatophagoides pteronyssinus. Epitelio de perro; epitelio de gato, mezcla de hongos anemófilos (Alternaria, Cladosporium favum y Hervarum, Chaetomium) (laboratorio Abelló, España), solución fisiológica como control negativo y clorhidrato de histamina, concentración 1: 1000, como control positivo.
Las Pruebas Cutáneas (Prick Test) fueron realizadas según la técnica modificada de Pepys (23).
Para las pruebas intradérmicas fue inyectado 0,02 ml, el extracto por dicha vía en la cara externa del antebrazo utilizando una jeringuilla hipodérmica. Los criterios de positividad de las pruebas cutáneos fueron:
- Pruebas de Puntura (Prick Test) – según normas pro-puestas por Lombardero (24). Fueron consideradas positivas las pruebas con pápula 3 mm mayor que el control positivo o igual o mayor que 5 mm;
- Pruebas intradérmicas – fue utilizada la medida del eritema según la técnica propuesta por Turkeltaub (25).
Fueron consideradas positivas la prueba cuya suma del mayor diámetro del eritema con diámetro perpendicular al punto medio del primero que fuere igual o superior a 50 mm (D50).
Determinación de IgE Específica
Para la demostración de IgE Específica fue utilizada la técnica de “immunoblotting” (22). Fueron probadas muestras de suero de 17 individuos que presentaron pruebas cutáneas po-sitivas. Como controles fueron utilizados sueros de tres individuos asintomáticos con Pruebas Cutáneas negativas.
En resumen, los extractos, debidamente concentrados, fueron sometidos a la electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE).
Después fue realizada la transferencia de las fracciones proteicas para el papel de nitrocelulosa. Y los sitios libres del papel fueron bloqueados con seroalbúmina bovina al 0,5 %.
Los sueros, diluidos 1:10, fueron incubados con las cintas de nitrocelulosa para detectar el acoplamiento de la IgE Específica, se introdujo el papel en una solución que contiene anti IgE humana conjugada con fosfatasa alcalina (sigma Chen. Co. EUA).
La reacción fue revelada por el NBT (nitrobluetetrazole).
Análisis estadística
Para comparar los resultados de las pruebas cutáneas, fué empleado el Test de Chi cuadrado; en todos los análisis fue considerado significante el p menor que 0,05.
Resultados
Evaluación Bioquímica
El extracto de Hemileia vastatrix al 10% obtenido con líquido de Coca presentó 0,087 mg/ml de proteínas, 0,931 mg /ml de carbohidratos, y 0,22 mg/ml de lípidos.
El extracto de Hemileia vastatrix al 10% obtenido on Tris-HCL presentó 0,42 mg/ml de proteínas, 0,934 mg/ml de carbohidratos y 0,365 mg/ml de lípidos .
Fraccionamiento y caracterización protéica
La electroforesis de los extractos de Hemileia vastatrix obtenidos respectivamente con líquido de Coca Tris-HCL, evidenció varias fracciones proteicas con pesos moleculares comprendidos entre 12 y 97 KD. Los perfiles electroforéticos de ambos extractos fueron semejantes (fig. 3).
Pruebas Cutáneas
La incidencia de Pruebas Cutáneas positivas en el total de la población estudiada varió del 8,73% a 9,34%, de acuerdo con el método y extracto utilizados (tabla 3).
NR- No realizado
*Diferencia estadísticamente significativa en relación a los grupos I y II
Se ve mayor incidencia de Pruebas Cutáneas positivos en las pruebas intradérmicas realizadas con extracto Hemileia vastatrix Coca (9, 34%). Sin embargo, no hubo diferencia estadísticamente significante entre esos resultados y los observados con las Pruebas Cutáneas. Así como en las Pruebas Intradér-micas con extracto de Hemileia vastatrix-Tris.
Considerando los resultados de las Pruebas Cutáneas, observamos concordancia con los resultados (positivo o ne-gativo) entre 82% y 96% en el mismo individuo, variando de acuerdo con el tipo de prueba y de extracto utilizados.
Frecuencia de pruebas positivas en los grupos estudiados
Si consideramos los resultados de las Pruebas Cutáneas (Prick Test) utilizando el extracto de Hemileia vastratix – Coca. Observamos que en el grupo I (= 51) se presentaron dos individuos con Prueba Cutánea positiva. Grupo II (n= 118) se presentaron siete individuos con prueba positiva. El grupo III (n= 57) se presentaron cinco individuos positivos. Grupo IV (n= 102), catorce. Y el grupo V (n= 50), cinco.
Tales resultados indican la siguiente frecuencia de pruebas positivas al Hemileia vastatrix:
- El Grupo I 3,92%
- Grupo II 5,93%
- Grupo III 8,77%
- El Grupo IV 13.72%
- Grupo V 10%.
No hubo diferencia estadística significante entre esos resultados y aquellos obtenidos con extracto de Hemileia vastatrix- Tris (tabla 4).
Autores
- *Miguel Croce. Becario de la Fundación de Amparo a la Investigación del Estado de Sao Paulo (Fapesp).
- 1 Miguel Croc, Fabio F. Morato Castro, Eliúde Rosa da Costa Manso, Julio Croce. Servicio de Alergia e Inmunología del Hospital de Clínicas de la Facultad de Medicina de la Universidad de Sao Paulo.
- 2 José Enrique Pereira Pinto. Facultad de Medicina de Itajuba – MG.
- 3 Walderez Gambale. Laboratorio de Alergenos Fúngicos del Instituto de Ciencias Biomédicas II (ICBII) – USP.
- 4 Enio Pasquali. Servicio de Neumología – Hosp. San Lucas Riveirao Preto – SP.
- 5 Claudia Eugenia de Oliveira Andrade. Clínica de Alergia e Inmunología Clínica Varginha – MG.
- 6 Jorge Kleber Chavasco. Escuela Federal de Odontología y Farmacia de Alfenas (Efoa), Alfenas – MG.
- 7 Lilian Takayama, Eloisa Bonfá. Laboratorio de Reumatología – Unidad de Inmunidad Humoral (LIM 17) de la Facultad de Medicina de la Universidad de Sao Paulo.
- 8** Santiago López Ortega. Alergólogo Inmunólogo de la Universidad de Sao Paulo, Brasil.
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