Caracterización de Staphylococcus Aureus aislados del Personal de Salud: Materiales y Métodos

Obtención de las Muestras

Se realizó un estudio de prevalencia en el personal de salud y en estudiantes expuestos al ambiente hospitalario del hospital San Juan de Dios, una Institución de tercer nivel de la ciudad de Cali. El estudio se desarrolló en la Sala de Recuperación de cirugía (SR) y la Unidad de Cuidados Intermedios (UCIN)  que cuenta con 220 camas.  La población que ingresa a estas salas corresponde a 496 personas, representadas en 150 profesionales de la salud y 346 estudiantes en prácticas,  el tamaño de la población fue calculada para un error de 4%, un nivel de 95% de confianza y un valor crítico  o  z de 1.96.

La muestra de estudio que comprendió 278 personas, se distribuyó en 62 profesionales de salud de la institución y 216 estudiantes de práctica. El grupo de estudiantes fue discriminado de acuerdo al tiempo de permanencia diaria en el área de práctica: 31 pertenecientes al tercer año (3 horas diarias de prácticas) , 69 correspondientes al cuarto año (5 horas de práctica), 55 del quinto año (8 horas de práctica)  y  61 que cursaban el sexto año (12 horas de prácticas). La distribución por género del grupo de estudio fue de 162 mujeres y  116 hombres.  En el grupo de estudiantes se evaluaron 122 mujeres y 94 hombres, mientras la distribución en el grupo de profesionales fue 40 mujeres y 22 hombres.  Este estudio fue avalado por el comité científico de ética y bioética de la Universidad Santiago de Cali, y realizado teniendo en cuenta las normas técnicas, científicas y éticas establecidas en el decreto 008430 de 1993 del ministerio de Salud y Protección Social de la República de Colombia.

Para el aislamiento de S. aureus se colectaron muestras de secreción nasal mediante la técnica de hisopado, en personas que no habían recibido tratamiento antibiótico en los últimos tres meses y no presentaban enfermedades respiratorias.

Condiciones de Cultivo

Las muestras se sembraron en agar salino manitol rojo de fenol (Oxoid Ltd., Hampshire, United Kingdom) y se incubaron por 24 a 48 horas a 37^oC. La identificación de S. aureus se efectúo por la fermentación del manitol en el agar selectivo (coloración amarilla del medio), la reacción positiva de la prueba de la coagulasa y la observación al microscopio de cocos Gram positivos en racimos a partir de un extendido directo con tinción de Gram, comparando con los valores estandarizados para la cepa control  de S. aureus ATCC 25923. El S. aureus se diferenció del estafilococo coagulasa negativo con el empleo de la prueba de la DNasa.

Pruebas de Sensibilidad a los Antibióticos

La prueba de sensibilidad antimicrobiana se realizó empleando el método de difusión en agar según las recomendaciones del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) ⁽²⁵⁾. Las colonias confirmadas como S. aureus se suspendieron en caldo de triptona hasta alcanzar la turbidez estandarizada  (0.5  D.O. de Mc Farland). La suspensión se inoculó en medio Mueller-Hinton (Scharlau Chemie S.A) y posteriormente se colocaron los sensidiscos, para las pruebas de los antibióticos. Se evaluó la sensibilidad a oxacilina (OXA, 1 μg), cefoxitina (FOX, 30 μg), cefalexina (CEF, 30 µg), gentamicina (GEN, 10 μg), ciprofloxacina (CIP, 5 μg), eritromicina (ERI, 15 μg), clindamicina (CLI, 2 μg), trimetoprim-sulfametoxazol (SXT 1,25/23,75 μg), tetraciclina (TCY, 30 μg), cloranfenicol (CHL, 30 μg), vancomicina (VAN, 30 μg), imipenem (IMP, 10 µg) y penicilina (PEN, 10U) (Oxoid). Los cultivos se realizaron por duplicado a 37^oC por 24 horas. Para verificar la acción de los sensidiscos se determinó el diámetro del halo de sensibilidad de acuerdo a los estándares de la CLSI ⁽²⁵⁾. Como control de sensibilidad se empleó la cepa de S. aureus ATCC 25923.  La determinación de fenotípica de los aislados SARM se realizó de acuerdo a la resistencia simultánea observada a los antibióticos oxacilina y cefoxitina.

Técnicas Genético-Moleculares

El ADN de las cepas referencia y de los aislados bacterianos se extrajo empleando el protocolo modificado de Cheng et al, 2006 ⁽²⁶⁾, que se basa en la lisis bacteriana utilizando solución de sacarosa al 25%, 10 mg/ml de lisozima y 1 mg/ml de proteinasa K, a 56^oC.

Para establecer a nivel molecular la resistencia a meticilina y vancomicina, se amplificaron los genes mecA y vanA, siguiendo el protocolo reportado por Tokue Y et al ⁽²⁷⁾ yFinks et al ⁽²⁸⁾ respectivamente. Se amplificó una banda 1334 pb del gen mecA empleando los cebadores  MR1, 5’ (478)-GTGGAATTGGCCAATACAGG-(497) 3’ y MR2, 5’ (1816)-TGAGTTCTGCAGTACCGGAT-(1797) 3’. Un fragmento de 732 pb  del gen vanA se amplificó utilizando los cebadores A1: 5’ (175)-GGGAAAACGACAATTGC-(191) 3’ y A2: 5’ (907)-GTACAATGCGGCCGTTA-(891) 3’.

Para determinar los cuatro grupos agr se amplificaron de manera independiente  fragmentos de 440 bp, 572 bp, 406 bp y 588 pb, respectivamente, empleando un juego de cebadores, conformados por el cebador universal en sentido, con la secuencia agr  5′-GTCACAAGTACTATAAGCTGCGAT-3′, y uno de los cebadores específicos para cada grupo en anti-sentido: agrI 5′-GTATTACTAATTGAAAAGTG CCATAGC-3′, agrII 5′-GTATTACTAATTGAAA AGTGCCATAGC-3,  agrIII  5′-CTGTTGAAAAAGTCAACTAAAAGCTC-3′ y agrIV 5′-CGATAATGCCGTAATACCCG-3´⁽²²⁾.

Las reacciones de PCR se realizaron en un volumen de 50 μl de una mezcla de reacción compuesta por MgCl₂ 25 mM,  200 μM de los cuatro dNTP’s, 0,5U de Taq DNA polimerasa (Invitrogen®), 10pmol de cada cebador y 5μl de solución de ADN en un termociclador GeneAmp PCR system 2400^®. Los productos de amplificación fueron visualizados después de la separación en el gel de agarosa al 2%, teñido con Bromuro de etídio, bajo luz ultravioleta. Como control positivo de amplificación por PCR de los genes mec y agr se tomó una cantidad de ADN similar de la cepa control de S. aureus y para el gen vanA de una cepa de Enterococos. Como control negativo de las reacciones se tomaron las mezclas de reacción sin ADN y una cantidad de ADN similar de la cepa ATCC 25922 de Eschericchia coli.

Análisis estadísticos

La unidad de análisis fue el aislado bacteriano obtenido del hisopado nasal, del cual se registró las características microbiológicas y moleculares y se relacionaron con las características sociodemográficas de los portadores como el género y ocupación. En el grupo de estudiantes se registró además el nivel académico (año). Las variables microbiológicas fueron la presencia de S. aureus, Staphylococcus-coagulasa-negativo (SCN) y el grado de sensibilidad o resistencia a cada antibiótico evaluado. Estas últimas variables fueron categorizadas en diferentes grados así: resistencia (1), sensibilidad intermedia (2) y sensibilidad (3), de acuerdo a los estándares para cada antibiótico establecidos para S. aureus.  Las variables moleculares fueron presencia de los genes mecA, van A y las variantes del agr. Se construyó una base de datos con las variables de interés, empleando el programa Excel^TM.

Los valores de las variables cuantitativas fueron expresados como porcentaje relativo de la población. La población de estudio se separó en dos grupos de acuerdo a la ocupación: profesionales de la salud y estudiantes. La presencia de S. aureus fue determinada como porcentaje de acuerdo a la ocupación, el tiempo de permanencia en el grupo de estudiantes y  el género. En el grupo de colonizados por  S. aureus se realizó análisis de asociación entre las distintas variables como el fenotipo de resistencia a los diferentes antibióticos, la presencia del gen mecA y la variante genética de agr, teniendo en cuenta la ocupación. En el grupo de estudiantes se discriminó la multirresistencia de acuerdo al tiempo de permanencia teniendo en cuenta el número de horas diarias de práctica, desde 3 horas para los estudiantes de IV año, 5 horas para V año, 8 horas para VI año.  Se determinó la prevalencia de las diferentes variantes de agr en los fenotipos SARM y SASM.

La significancia en las diferencias en la frecuencia de las variables entre los grupos establecidos fue determinada por análisis estadístico, empleando la prueba de chi-cuadrado de Pearson. La significancia estadística fue asignada para valores de p<0,05, considerando un nivel de confianza del 95% (alfa) y un error (beta) de 5%.  Los análisis estadísticos se realizaron empleando el paquete estadístico SPSS vs 20.0.