Definición de Subtipos del Síndrome de Usher, Pruebas Moleculares

Análisis de haplotipos

El ADN fue extraído por medio de la técnica Fenol-Cloroformo. Se analizaron los 12 loci conocidos asociados al USH en las familias informativas. Se amplificó el DNA por PCR para los marcadores STRP del kit Linkage Mapping Set v2.5 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Las PCR fueron purificadas y analizadas en el equipo ABI-PRISM 3130xl, los resultados analizados con el software GeneMapper v4.0 (Applied Biosystems, Foster City, CA) y los haplotipos construidos con el software GeneScreen (IttyBitty Computers, San Jose, CA).

Análisis de SSCP

Se realizó análisis de SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) para los 21 exones que codifi can para la isoforma corta del gen USH2A en los individuos con USH tipo II. Las amplificaciones se realizaron en el termociclador icycler BIO-RAD. Se utilizó el siguiente protocolo estándar: un ciclo inicial de 95ºC por 5 minutos, 30 ciclos de 95ºC por 1 minuto, la temperatura de anillamiento correspondiente en cada caso por 1 minuto y 72ºC por 1 minuto, seguidos por un ciclo de elongación final a 72ºC por 7 minutos. Una vez obtenidos los productos se realizó análisis de SSCP para cada uno de los exones, en las cámaras DeCode y Mini- Proteam II de BIO-RAD, según las condiciones de estandarización en cada caso. Las bandas fueron visualizadas con tinción de nitrato de plata. Los patrones anormales fueron secuenciados.

Análisis de secuenciación

Se secuenciaron aquellos exones en donde se ha reportado mayor frecuencia de mutaciones de los genes asociados a cada subtipo segregado.

Adicionalmente, se realizó secuenciación del exón 13 y de todos los patrones anormales detectados por análisis de SSCP del gen USH2A. El procedimiento utilizado para la secuenciación fue el siguiente: una vez obtenido el producto de PCR se purifi có y se realizó la reacción de secuenciación con 2ul de ready reaction mix, 2ul de buffer 5X, 1ul de primer y 5ul de producto purificado. Las condiciones de temperatura fueron: 95ºC por 10 segundos, 50ºC por 5 segundos y 60ºC por 4 minutos, por 35 ciclos. Se realizó la precipitación de la reacción de secuenciación por el método de etanol. Las secuencias se realizaron en el ABIPRISM 3100-Avant con el kit de secuenciación BigDye terminator versión 3.1. Finalmente, se realizó el análisis de secuencias con el software DNAstar.

Resultados

Se diagnosticaron 72 individuos con USH para el presente estudio: 45 (62.5%) corresponden a USH1, y 27 (37.5%) a USH2. De la población con USH1 (45 individuos) se logró identifi car el subtipo genético en 9 de ellos: 6 del subtipo USH1B, uno del USH1D, uno del USH1F y uno del USH1G. Una familia USH1 no mostró segregación con los loci conocidos para el USH. Se logró identificar la mutación causal de la enfermedad en tres de los individuos con USH1B.

La primera de las mutaciones identificadas en el gen MYO7A, corresponde a una mutación previamente reportada, la c.1900C>T, p.R634X (27) en el exón 16 en un individuo perteneciente a una familia consanguínea clasificada como USH1B (familia 10USH) (figura 1). La mutación se encuentra en estado homocigoto en los 3 individuos afectados y en estado heterocigoto en los 2 progenitores y en 6 de los hermanos sanos. Esta mutación representa una frecuencia alélica del 2.2%.

La segunda mutación se identificó en dos propósitos. Uno de ellos, es un individuo perteneciente a una familia no consanguínea con 3 individuos afectados (familia 35USH) (figura 1). Se trata de un cambio en el exón 45, c.5956C>T, p.R1986X (figura 2). La mutación fue identificada en estado homocigoto en los 3 afectados de la familia y en estado heterocigoto en los dos progenitores y la hermana sana. Esta misma mutación fue identificada en otro individuo no relacionado en estado heterocigoto representando una frecuencia alélica del 3.3% y no fue identificada en 50 controles sanos colombianos no relacionados. Adicionalmente, se identificaron algunos polimorfismos en el gen MYO7A previamente reportados (Tabla 1).

De la población con USH2 (27 individuos), se logró identificar el subtipo genético en 14 de ellos: 13 USH2A y uno USH2C. Se identificaron tres mutaciones en el gen USH2A: La primera de ellas, la mutación c.2299delG en el exón 13 previamente reportada fue identificada en 7 individuos (26), representando una frecuencia alélica del 14.8%; se identificó en estado homocigoto en un individuo y en sus 2 hermanos afectados. Adicionalmente se identificó en estado heterocigoto en otros 6 individuos no relacionados, en 4 de ellos el otro alelo aún no ha sido identificado y en los otros dos se identificó en estado heterocigoto compuesto con la mutación p.R334W. La mutación, p.R334W presente en el exón 6 previamente reportada (28), también fue identificada en dos individuos no relacionados en estado homocigoto para una frecuencia alélica del 11.1%. La tercera mutación, reportada por los autores previamente (29), se identificó en el exón 1 en la región 5’UTR, en un individuo perteneciente a una familia consanguínea con 3 individuos afectados. Se trata de una transversión G→T en la posición 129, a 259 pb corriente arriba del codón de inicio ATG. El cambio se encuentra en estado homocigoto en los 3 individuos afectados y en estado heterocigoto en todos los demás individuos de la familia. El cambio no fue identificado en 100 controles sanos colombianos. En la familia clasificada como USH2C, no se identificó mutación.