Premio Area de Ciencia Básicas: Interferencia de la Infección por Rotavirus

Mediante la inhibición de la actividad de la proteína disulfuro isomerasa (PDI) de la membrana celular de las líneas MA104 y Caco-2

Carlos A. Guerrero1, Martha N. Calderón2,
Orlando Acosta1, Fanny Guzmán2

Resumen

Los rotavirus son la causa más común de gastroenteritis severa en niños menores de cinco años, ocasionando episodios diarreicos agudos responsables de 454.000 a 705.000 muertes anuales a nivel mundial.

Aunque la frecuencia de infección con rotavirus es muy similar a través del mundo, en los países en desarrollo la gastroenteritis rotaviral es la mayor causa de muerte infantil.

La diarrea rotaviral severa cursa con vómito y fiebre, produciendo deshidratación con shock, desbalance electrolítico, y muerte si ésta no es tratada. (Lea también: Premios a las Ciencias Médicas, Rotavirus, Efectos Adversos Evitables y otras Investigaciones)

En los países desarrollados, la infección rotaviral es responsable del 30-50% de las hospitalizaciones debidas a gastroenteritis en menores de 5 años. Además, los rotavirus son una causa importante en la gastroenteritis nosocomial.

En el ciclo de infección viral, la etapa de entrada del virus a la célula hospedera es un evento candidato a ser interferido con el fin de evitar o atenuar la infección viral. Tal propósito requiere del conocimiento detallado del mecanismo molecular y celular implicado.

En este contexto, en un trabajo original previo los autores aislaron cuatro proteínas (Hsc70, integrina 3, actina y miembros de la familia PDI) candidatas a jugar un papel como receptores en el proceso de entrada del rotavirus a la célula.

De estas proteínas, la Hsc70 y la integrina 3 han sido descritas como receptores en el proceso infeccioso en trabajos publicados por el autor principal y confirmadas otros investigadores en diferentes países.

Actina ha sido relacionada con el proceso replicativo y salida del virión de la célula infectada, en reportes de otros investigadores. La familia de las PDI, hasta el momento, no ha sido reportada en publicaciones internacionales como componente del proceso de entrada de los rotavirus a la célula. En el presente trabajo, por primera vez se reporta la participación de la proteína disulfuro isomerasa (PDI) en el proceso de entrada de los rotavirus.

Actualmente han sido descritas varias moléculas receptoras implicadas en la unión inicial (adherencia) de la partícula rotaviral a la superficie de la célula y en los eventos subsiguientes de pos-adherencia. Tales moléculas receptoras incluyen las integrinas (11, v3, x2, 41, 47) y la proteína de choque térmico Hsc70 de la membrana celular.

Aparentemente, de acuerdo con la cepa rotaviral y la especie animal infectada, los virus presentan preferencias hacia una u otra molécula receptora, sin perjuicio de la utilización secuencial de más de una proteína receptora.

Como parte del mecanismo propuesto, las proteínas estructurales de la partícula viral o diferentes partes de éstas (dominios), interactúan secuencialmente con las moléculas de la superficie celular. Nuestra hipótesis presupone la ocurrencia de modificaciones o rearreglos de la estructura tridimensional (denominados cambios conformacionales) de las proteínas de la partícula viral. Para que estos cambios conformacionales se sucedan, es necesaria la presencia en la superficie de la membrana celular de proteínas que los realicen.

Entre las proteínas candidatas a realizar estos rearreglos tridimensionales se encuentran las proteínas de la familia disulfuro isomerasa (PDIs), las cuales presentan actividad isomerasa a través de reacciones de óxido-reducción (redox) que interconvierten los grupos tiol/disulfuro (-SH/-S-S-) de las cisteínas que hacen parte de la secuencia de aminoácidos de las proteínas, ocasionando de esta manera cambios conformacionales alternativos (isómeros) en las proteínas sobre las cuales actúan las PDIs.

Esta actividad redox está documentada en el retículo endoplásmico (RE), donde contribuye en el proceso de ensamblaje de partículas virales y en el plegamiento de sus proteínas junto con calnexina y calreticulin.

Con base en los anteriores antecedentes, decidimos determinar la implicación de la actividad de PDI de la membrana citoplasmática de las líneas celulares MA104 y Caco-2 en el evento de entrada de los rotavirus a estas células.

Planteamos como objetivo general determinar la interferencia del proceso infeccioso del rotavirus cuando se inhibe la actividad de las proteínas PDIs. Como parte del cumplimiento de los objetivos específicos se desarrollo una metodología la cual incluyó:

1. Inhibición de la actividad redox presente en la membrana celular con DTNB (5,5’-ditiobis2-ácido nitrobenzóico) y bacitracina, reactivos que no son permeables a esta membrana, asumiendo que al inhibir esta actividad el virus no puede realizar los cambios conformacionales necesarios para las interacciones subsecuentes con las distintas moléculas de la superficie celular, disminuyendo así la infección viral.

2. Utilización de anticuerpos contra proteínas específicas de la familia de las PDIs, para determinar cuál de ellas está implicada en la entrada de los rotavirus a células MA104. Se asumió que al bloquear con anticuerpos las proteínas de la superficie celular de esta familia, el rotavirus nopuede interactuar con éstas, hecho que conlleva a la disminución de la infección viral.

3. Una vez establecido que los anticuerpos que inhiben la infección viral son los dirigidos contra la proteína disulfuro isomerasa (PDI), la ubicación en la superficie celular de esta proteína se confirmó aún más utilizando técnicas de inmunofluorescencia indirecta, citometría de flujo y marcaje con biotina (biotinilación) de proteínas de la superficie celular con un reactivo (Sulfo NHS-SS-Biotin) impermeable a la membrana celular, seguido de la separación de estas proteínas biotiniladas por su afinidad con la proteína avidina y análisis de esas proteínas mediante la técnica de “Western blotting” (separación de proteínas por electroforesis en gel y transferencia de éstas a una membrana de nitrocelulosa, para su detección con anticuerpos específicos).

4. Teniendo en cuenta que la proteína Hsc70 y la integrina 3 están presentes en la membrana citoplasmática, en microdominios lipídicos denominados “rafts” (o también balsas lípidicas), se determinó si PDI de la membrana celular también está presente en dichos microdominios lipídicos y, si en caso de estarlo, si su interacción es directa o indirecta con las anteriores proteínas. Para esto, el componente lipídico de los “rafts” fue removido y las proteínas remanentes se examinaron mediante “Western blotting”.

5. Determinación de la interacción entre PDI y el virión en ensayos in vitro e in vivo mediante ELISA y “Western blotting” analizando la formación de complejos protéicos entre estas dos entidades. También se examinó si al adicionar el virus a las células y extraer los microdominios lipídicos “rafts”, en éstos se localizaría la PDI en interacción con las proteínas estructurales del rotavirus.

6. Se utilizaron péptidos sintéticos correspondientes a regiones de proteínas estructurales de rotavirus, que incluyen cisteínas (aminoácido sustrato de PDI a través el grupo -SH) en su secuencia, con el propósito de identificar los dominios de las proteínas virales que son sustrato de la PDI, realizando ensayos de infección de la célula en presencia y ausencia de los péptidos; se determinó además la interacción entre la PDI y los péptidos.

El aminoacidocisteína, a través del grupo tiol (-SH), puede generar mediante oxidación puentes disulfuro (-S-S-), lo cual produce cambios conformacionales en la estructura tridimensional de la proteína así oxidada. Igualmente, la reducción de los puentes de disulfuro para regenerar los grupos tiol, también ocasiona cambios conformacionales en la proteína reducida.

Aunque la PDI interactúa con las proteínas de dos formas: (i) a través de la actividad redox (intercambio tiol/disulfuro) sobre las cisteínas, o (ii) a través del actividad de “chaperona” (acompañamiento en la solubilización y transporte de proteínas independientemente del intercambio tiol/disulfuro), se enfatizó en el análisis de la actividad redox.

Para esto, se utilizaron los péptidos sintéticos (con sus respectivos controles) en ensayos tanto in vitro como in vivo. Los controles incluyeron péptidos sintéticos con la misma secuencia de aminoácidos pero con las cisteínas cambiadas por serinas, los mismos aminoácidos en secuencias aleatorias o péptidos con secuencias no relacionados con las proteínas de rotavirus pero que contuvieran cisteínas.

Con el objeto de determinar si el dominio de la estructura tridimensional de la proteína que contiene la secuencia peptídica sintética se encuentra expuesta en la partícula viral (virión), se generaron en conejos anticuerpos contra algunos de los péptidos sintéticos para determinar si dichos anticuerpos reconocían las proteínas del virión y si eran capaces de bloquear la infección viral.

Los resultados del presente trabajo sugieren lo siguiente:

1. En este trabajo se reporta por primera vez que la PDI se localiza en la superfi cie de la membrana celular de las células MA104 y Caco-2, permisivas a la infección por rotavirus, en una concentración muy inferior a la encontrada en el interior de la célula.

2. La infección con las cepas de rotavirus RRV o Wa disminuyó cuando las líneas celulares utilizadas se incubaron previa o simultáneamente con las partículas virales infecciosas y con los inhibidores de la actividad redox de la superficie de la membrana celular, tales como bacitracina y DTNB en concentraciones que no son tóxicas para la célula. Estos reactivos no impidieron la unión (adherencia) del virus a la célula y no inhibieron la replicación viral cuando se adicionaron después que el virus ingresó a la célula.

Esto sugiere que la actividad redox es importante para el ingreso del virus a la célula, probablemente induciendo en las proteínas del virión cambios conformacionales necesarios para exponer dominios de las proteínas necesarios para interactuar con otras proteínas receptoras de la membrana celular.

3. La infección del rotavirus se inhibe al preincubar las células con anticuerpos específicos anti-PDI. Los anticuerpos dirigidos contra otras proteínas de la familia de las PDIs no mostraron efecto inhibitorio sobre la infección viral.

La inhibición de la infección con anticuerpos anti-PDI fue mayor que la realizada por los reactivos que inhiben la actividad redox, probablemente porque también están interfiriendo la actividad de “chaperona”, en el caso que esta actividad también estuviera implicada en la entrada del rotavirus. Los anticuerpos anti-PDI no impidieron la unión (adherencia) del virus a la célula.

Esto sugiere que al bloquear la PDI con anticuerpos, su interacción con el virión se ve abolida, interfiriendo de esta manera los cambios conformacionales de las proteínas virales requeridos para las interacciones subsecuentes conducentes a la internalización del virus.

4. La PDI se une a los viriones purificados (TLPs, partículas con triple cubierta protéica) de las cepas rotavirales RRV o Wa, de acuerdo con los resultados obtenidos en un sistema in vitro libre de células, en el cual la PDI soluble fue analizada mediante ELISA y “Western blotting”. La unión de PDI y el virión disminuye en presencia DTNB, reactivo que interfiere la actividad redox de la PDI.

Los resultados sugieren que PDI interacciona con las partículas rotavirales, probablemente a través de los grupos tiol/disulfuro asociados a las cisteínas, sin descartar la posible interacción mediada por la función “chaperona” de PDI.

5. La entrada del virus a la célula se bloqueó al incubarlas con péptidos sintéticos correspondientes a regiones de proteínas virales que contienen cisteínas, como también con los anticuerpos generados contra dichos péptidos.

La unión de los péptidos sintéticos a la PDI fue disminuida notoriamente, así como la inhibición de la infección de las células, como consecuencia del cambio de las cisteínas por serina en la secuencia de los péptidos. Sin embargo, al cambiar las cisteínas por serinas el efecto inhibitorio de los péptidos no desapareció totalmente.

En su conjunto, estos experimentos sugieren que los dominios de las proteínas virales que contienen las secuencias peptídicas ensayadas son posibles sustratos de la PDI.

6. La PDI aquí descrita se encuentra presente sobre la membrana de las células haciendo parte de los microdominios lipídicos “rafts”, formando complejos proteicos con la proteína Hsc70 y la integrina v3. Esto sugiere que en estas líneas celulares la PDI está relacionada, mediante interacciones proteína-proteína, con la Hsc70 y la integrina v3 y que este complejo proteico participa en la entrada del rotavirus a la célula.

En resumen, los resultados aquí presentados permiten fortalecer el mecanismo propuesto consistente en que el rotavirus interacciona con varias proteínas de la membrana celular, de las cuales, la integrina v3, la Hsc70 y la PDI forman un complejo proteico. Durante su entrada el rotavirus estaría utilizando diferentes proteínas virales o diferentes dominios de ellas, en un evento secuencial de múltiples interacciones con las distintas moléculas receptoras de la membrana celular.

Para que se produzcan los cambios conformacionales requeridos por las proteínas virales, la actividad de la PDI en membrana debe intervenir, dado que al bloquear esta actividad con anticuerpos o con diferentes reactivos, se disminuye la infección viral.

Este trabajo reporta por primera vez a nivel internacional, que la PDI está implicada en el proceso de entrada de los rotavirus a la célula al menos a través de su actividad redox. Este hallazgo es de gran importancia puesto que nos ha permitido iniciar la búsqueda de herramientas terapéuticas ya existentes o en experimentación, que interfieran la actividad enzimática disulfuro-isomerasa y en consecuencia coadyuven en la lucha contra la infección por rotavirus.

Preliminarmente se han analizado diferentes moléculas con la propiedad de interferir el intercambio tiol-disulfuro que podrían ser de mucha utilidad para casos en los que las vacunas, recientemente liberadas al mercado y aun en estudio, presenten poca eficiencia o no sean de fácil acceso, como sucede en áreas socio-económicamente deprimidas en los países en desarrollo. Igualmente, estos métodos profi lácticos podrían ser utilizados en los animales de interés zootécnico, para los cuales en la actualidad no se han desarrollado vacunas.

1 Laboratorio de Biología Molecular de Virus, Facultad de Medicina.

2 Departamento de Química, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia.