Interferencia de la Infección por Rotavirus, Introducción

El rotavirus ha sido reconocido como el principal agente causal de gastroenteritis severa en niños. La Organización Mundial de la Salud (OMS), reporta entre 454.000 y 705.000 muertes de niños debido a la infección producida por rotavirus.

El 82% de estas muertes ocurre en los países en vías de desarrollo, primordialmente en África y Asia, mientras que en los países desarrollados es una importante carga asistencial, con un costo socio-económico alto pero con una baja mortalidad. (Parashar et al., 2006).

También afecta especies animales de importancia económica (bovinos, porcinos, aves) (Yaeger y Anderson, 2003) y hay reportes que indican transmisión de rotavirus de animales a humanos (Matthijnssens, et al., 2006; Martella et al., 2006). (Lea también: Premio Area de Ciencia Básicas: Interferencia de la Infección por Rotavirus)

Después de la primera vacuna tetravalente recombinante de rotavirus, la RotaShield, retirada del mercado por asociarse a casos de intususcepción, dos nuevas vacunas, Rotarix y RotaTeq han mostrado seguridad y eficiencia para proteger de la gastroenteritis rotaviral, con reportes que oscilan entre el 74% y 100% (Angel et al., 2007; Dennehy, 2007).

El rotavirus, perteneciente a la familia Reoviridae, es un virus icosahédrico que carece de envoltura bilidipídica, cuyo genoma está compuesto de 11 segmentos de RNA de doble cadena protegido por tres capas protéicas concéntricas, que incluyen6 proteínas estructurales (VP).

La capa interna la conforma la proteína VP2 formando la nucleocápside que envuelve el genoma viral y a las proteínas VP1 (RNA polimerasa dependiente de RNA) y VP3 (guanilil-transferasa y metilasa).

La capa intermedia la forma la proteína VP6 conformando partículas de doble capa o DLPs, transcripcionalmente activas pero no infecciosas; la capa externa está compuesta por dos proteínas, VP7 y VP4, que estructuran la partícula infecciosa de triple capa protéica o TLPs.

Trímeros de VP7 conforman una superfi cie lisa mientras que VP4 se extiende hacia afuera con estructuras diméricas en forma de espículas (Estes, 1996 y 2001). Ambas proteínas se han reportado como las principalmente involucradas en las interacciones del virus con la célula hospedera (López y Arias, 2004).

Los rotavirus infectan principalmente enterocitos maduros en las vellosidades del intestino delgado, con propagación de la infección fuera del intestino hacia los nódulos linfáticos mesentéricos y tejidos periféricos (Mossel y Ramig, 2003; Fenaux et al., 2006, Blutt et al., 2007); in vitro, infectan a diferentes líneas celulares, en especial células epiteliales de origen renal, intestinal y hepático, entre ellas las Vero y MA104 de riñón de mono verde africano, y las Caco-2 de cáncer de colon humano (Londrigan et al., 2000, Ciarlet et al., 2002a).

Estas líneas han sido los principales modelos celulares en la elucidación de los mecanismos de entrada, replicación e infección de rotavirus; sin embargo muchos de los eventos moleculares de entrada, ensamblaje y salida del rotavirus aún son objeto de investigación.

La unión (adherencia) de algunos rotavirus ala célula hospedera es dependiente de la presencia de ácido siálico (AS) en la superfi cie celular.

También están implicadas como receptores rotavirales varias integrinas (12, v3, x2, 41, 47) y la proteína Hsc70, especialmente en el proceso de post-adherencia (Superti et al., 1991; Coulson et al., 1997; Hewish et al., 2000; Guerrero et al., 2000a; Guerrero 2002; Ciarlet et al., 2002; Zarate et al., 2004; Gram et al., 2005; Gualtero et al., 2007).

Varias de estas moléculas receptoras y las proteínas rotavirales VP4, VP6 y VP7 han sido asociadas con los microdominios lípidicos “rafts” durante los eventos iniciales de la entrada del rotavirus a la célula (Isa et al., 2004). Sin embargo, el mecanismo mediante el cual las integrinas y la proteína Hsc70 participan en la internalización del virus hacia el citoplasma celular todavía no está definido.

Al parecer, la infección es un evento de múltiples pasos e interacciones secuenciales que sugiere cambios conformacionales (modificaciones de la estructura tridimensional) en las proteínas del virión, los cuales permiten exponer diferentes dominios (regiones de la proteína) para proseguir con la unión y penetración a la célula (Méndez et al., 1999; López et al., 2004; Halasz et al., 2005; López et al., 2006, Gualtero et al. 2007).

La enzima tripsina induce uno de los primeros cambios estructurales descritos sobre la proteína VP4, mediante el corte de la secuencia de aminoácidos en la región 241-247 con producción de las proteínas VP8 y VP5, lo cual se refleja en un aumento de la infectividad del rotavirus (Estes et al., 1981; López et al., 1985; Arias et al., 1996).

Se ha propuesto que la acción de la tripsina podría estar afectando la conformación de VP7, que conlleva a la permeabilización de la membrana independientemente de VP4 (Charpilienne et al., 1997).

La estructura de la partícula viral también es dependiente de la concentración de calcio y la configuración trimérica de la proteína VP7 se estabiliza con este ión, al parecer mediando cambios conformacionales que estarían contribuyendo en parte a los cambios que sufre VP7 en el proceso de internalización. Esto explicaría el aumento de la infectividad viral con el incremento en la concentración de calcio (Shah Rabadi et al., 1987; Fajardo et al., 1997; Pando et al., 2002).

Se ha sugerido que durante la infección la interacción del virus con la proteína Hsc70 de la superficie celular implica reconocimiento de dominios que están localizados en regiones protéicas no expuestas en el virión, como la porción carboxi-terminal de la proteína VP5. Esta interacción también podría incluir la región 280-297 de la proteína VP6 (Pérez-Vargas, J. 2006; Gualtero et al. 2007).

Un posible mecanismo para la exposición de estos dominios podría requerir de una actividad enzimática celular que le permita a las proteínas del virus ser objeto de reacciones de intercambio tiol (-SH)/disulfuro (-S-S-), en las cisteínas presentes en las proteínas de la cubierta del virus.

Las proteínas con actividad disulfuro isomerasa (PDIs) asociadas a la membrana celular son las moléculas candidatas a realizar este proceso. El objetivo de este trabajo fue elucidar si las proteínas con actividad disulfuro isomerasa de la superficie celular están relacionadas con el proceso de entrada de los rotavirus RRV y Wa a las células Ma104 y Caco-2.

Las PDIs constituyen una familia de enzimas estructuralmente relacionadas que catalizan la formación, reducción e isomerización de puentes disulfuro, principalmente de las nuevas proteínas sintetizadas en el lumen del retículo endoplasmático. Las PDIs actúan como “chaperonas” y por ello hacen parte del sistema de vigilancia del correcto plegamiento de las proteínas (Xiao et al., 2005).

Un miembro de esta familia es la PDI (EC 5.3.4.2), una oxido-reductasa cuya función redox involucra la secuencia aminoacídica distintiva (motivo) Cys-Gly-His-Cys (CXXC), que constituye el sitio activo de la enzima localizado en los dominios a y a’ de esta proteína (Freedman et al., 1989).

La PDI también está presente en la superficie celular, aunque carece del sitio clásico de unión a membrana, y se encuentra en concentraciones muy inferiores a las determinadas en el retículo endoplásmico (Ryser et al., 1997).

La PDI de la membrana celular se ha involucrado en el mantenimiento del estatus reductivo de la membrana plasmática, también en procesos que incluyen adhesión celular, maduración de las plaquetas, transporte de oxido nítrico, modulación de la actividad de la trombospondina e interacción con el ectodominio del receptor de la tirotropina humana (Pariser et al., 2000; Bennett et al., 2000; Essex et al., 1995; 2000; Essex et al., 2001; Ramachandran et al., 2001; Huang et al., 1997; Couet et al., 1996).

PDI actúa en la reducción de uno de los puentes disulfuro de la toxina de la difteria requerido en la entrada a las células; se sugiere que PDI cataliza la remodelación de la proteína gp120 del virus de la inmunodeficiencia humana-1 (HIV-1) en el proceso de entrada y por ello se ha postulado la PDI como un blanco potencial en terapias anti-HIV (Mandel et al., 1993; Barbouche et al., 2005, Ryser et al., Fluckiger et al., 2005).

Dentro de la investigación de la búsqueda de receptores celulares para rotavirus, el análisis de las proteínas obtenidas a partir de un extracto derivado del tratamiento de las células MA104 con el detergente no iónico octil--glucósido en condiciones en que no ocurre lisis celular, permitió aislar proteínas con habilidad de bloquear eficientemente la infección por rotavirus (Guerrero, 2000b).

En este estudio, el Dr. C.A. Guerrero (2000b) determinó que la proteína de 73KDa compartía en 100% identidad con la proteína Hsc70, caracterizándola como receptor de post-adherencia para rotavirus; mientras que la proteína de 57 KDa fue relacionada con dos miembros de la familia de las PDIs (Guerrero et al., 2000; 2002c).

Los resultados del presente trabajo dan evidencia de la inhibición de la infección rotaviral cuando se bloqueó la actividad redox de la proteína disulfuro isomerasa (PDI) asociada a la membrana celular con reactivos como el DTNB y la bacitracina o con anticuerpos específicos contra la PDI.

De igual forma, se analizaron péptidos rotavirales que estarían actuando como posibles sustratos de la enzima, inhibiendo por competencia la infección de las células MA104 con la cepa rotaviral RRV. Además, se demostró que la PDI asociada a la membrana celular de células permisivas a la infección por rotavirus forma complejos proteicos con este virus.